<< Pagina precedentã | Despre autori | Cuprins | Home | Pagina urmãtoare>>

 

1. Drojdiile ca agenţi biotehnologici

Introducere

            Microorganismele incluzând bacteriile, drojdiile, fungii filamentoşi şi algele unicelulare au fost folosite în culturi submerse pentru obţinerea diferitelor produse printre care şi biomasa proteică. De la începuturile producţiei pe scară largă de penicilină, streptomicină şi de alte antibiotice şi până la conversia steroizilor de către o varietate de microorganisme, s-au dezvoltat şi o serie de echipamente pentru culturile submerse dintre care, mai utilizate sunt două tipuri: bioreactorul cu agitare mecanică, cu diferite variante de agitatoare şi sisteme de spargere a spumei, fermentatorul airlift care poate fi considerat un hibrid între fermentatorul clasic cu agitare mecanică şi tipul cu draft al fermentatorului airlift.

            Factorii limitativi ai dezvoltării celulare în astfel de echipamente de fermentaţie sunt transferul de căldură şi transferul de masă, ultimul influenţând folosirea nutrienţilor, în special a oxigenului de către celule precum şi cantitatea produşilor de metabolism.

            În jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogată literatură de specialitate, care descrie efectul acestor factori asupra dezvoltării culturilor submerse microbiene, cu punerea în evidenţă a factorului limitativ pentru producţia de masă celulară şi de metaboliţi primari sau secundari. [1]

            În Figura 1 sunt prezentate principalele aplicaţii industriale tradiţionale şi moderne ale drojdiilor bazate pe exploatarea dezvoltării drojdiilor şi pe procesele metabolice specifice acestora la nivel industrial [2] .

Figura 1. Biotehnologii tradiţionale şi moderne bazate pe drojdii.

            Accentul este pus pe relaţia dintre fiziologia celulelor de drojdie şi biotehnologie pe de o parte şi ADN recombinant şi tehnologiile de fermentaţie pe de altă parte. Privitor la drojdiile non Saccharomyces, creşterea importanţei lor industriale este în particular datorată producţiei masive de substanţe şi preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evidenţiată importanţa drojdiilor ca modele experimentale în studiile fundamentale ale ştiinţelor biomedicale [3] .

1.1. Aspecte privind biologia drojdiilor

            Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece în cea mai mare măsură sunt utilizate pentru producerea de alimente, vin, bere, substanţe bioterapeutice şi produse farmaceutice. În prezent au fost recunoscute aproximativ şapte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile sunt adesea utilizate în biotehnologia tradiţională şi modernă, descoperirea de noi specii este legată şi de noile tehnologii.

            Pentru descrierea domeniului drojdiilor au fost utilizate mai multe definiţii. În conformitate cu Guilliermond (1912) şi Lodder (1970) [4] drojdiile sunt fungi unicelulari cu reproducere prin înmugurire ori fisiune. În acest sens, s-a recunoscut că drojdiile sunt fungi unicelulari adevăraţi, dar în realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice şi produc pseudohife şi hife, pe lângă dezvoltarea unicelulară. Similar, majoritatea fungilor hifali sunt dimorfici şi, în mod uzual, aceştia au fost denumiţi yeast – like.

            Identificarea, numirea şi plasarea drojdiilor în propiul lor cadru evolutiv sunt importante pentru multe domenii ale ştiinţei care includ agricultura, medicina, ştiinţele biologice, biotehnologia, industria alimentară.

            Investigaţii comparative care includ morfologia, fiziologia, genetica, biochimia, ecologia şi genetica moleculară, au îmbogăţit taxonomia drojdiilor.

            Prima perioadă în sistematica drojdiilor care se situează până la nivelul anilor 1960, este caracterizată prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriţională comparată şi genetică convenţională.

            Iniţial pentru utilizări taxonomice se foloseau teste care se refereau la numărul atomilor de carbon asimilaţi şi la folosirea compuşilor azotului. Wickerman (1951) a extins aceste cercetări şi astăzi aproximativ un număr de 60 de teste sunt utilizate curent şi ele includ fermentaţia şi asimilarea compuşilor carbonului, asimilarea compuşilor azotului, cerinţele în vitamine, rezistenţa la cycloheximide, necesităţi de temperatură.

            Studiile genetice relevă prezenţa diferitelor stadii sexuale. Ciclul sexual la ascomicete poate fi haplontic, diplontic ori diplohaplontic. Speciile de drojdii pot fi homotalice, heterotalice, sau o combinaţie a acestora. [5]

            A doua perioadă în sistematica drojdiilor este considerată de la 1960 până în prezent, şi este caracterizată printr-o aprofundare a studiului caracterelor morfologice datorită introducerii microscopiei electronice, a aplicării criteriilor biochimice şi a introducerii studiilor de genetică moleculară. Microscopia cu transmisie de electroni a relevat diferenţe între drojdiile ascomicete şi bazidiomicete. Drojdiile ascomicete au pereţii celulari transparenţi la electroni şi conţin în majoritate β - glucani, pătura externă fiind formată din α - manani. Drojdiile bazidiomicete au pereţii celulari cu o structură lamelară netransparentă la electroni şi formaţi în majoritate din β - glucani. Formarea mugurelui este de asemenea diferită la cele două grupuri de drojdii. Drojdiile ascomicete prezintă o înmugurire holoblastică, care constă în participarea întregului perete celular, la formarea noului perete, a mugurelui pe când la drojdiile bazidiomicete care au o înmugurire enteroblastică, participă numai stratul interior al peretelui celular.

            Ultrastructura septului arată diferenţe importante între cele două clase de drojdii. Septul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai mulţi micropori. Septul simplu are un singur por central, pe lângă unii pereţi despărţitori de la unele bazidiomicete, care au o structură de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membrană perforată numită parentezom.

            Pentru diferenţieri taxonomice au fost utilizate caracteristici biochimice, compoziţia în glucide a pereţilor celulari şi capsulelor, spectrul de rezistenţă magnetică a pereţilor celulari, numărul unităţilor izoprenice din coenzima Q, citocromii, compoziţia în acizi graşi şi paternul izoenzimelor. [6]

            Introducerea studiilor ADN, furnizează în principal, un parametru obiectiv în estimarea distanţelor evolutive din punct de vedere taxonomic. Diferitele metode utilizate oferă soluţii la diferite niveluri taxonomice. Valoarea taxonomică a compoziţiei în baze a ADN (mol% G+C) este în special caracteristică taxonomică de specie. Tulpinile fenotipice care diferă au un procent mai mare de 2 – 3% în compoziţia bazelor, sunt considerate specii diferite. Limitele în compoziţia de baze a ADN, diferă pentru drojdiile ascomicete şi bazidiomicete. Cele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de guanină şi citozină (mol% G+C) mai mic de 50, pe când majoritatea bazidiomicetelor au acest procent peste 50 (Tabelul 1).

Tabelul 1. Distribuţia mol% G+C la diferite ascomicete şi bazidiomicete

Mol% G+C

Procentajul la drojdiile ascomicete

Procentajul la drojdiile bazidiomicete

25 – 20

30 – 34

35 – 39

40 – 44

45 – 49

50 – 54

55 – 59

60 – 64

65 - 69

  0,75

14,5

28

32,5

16

  5,5

  2

  0,75

-

-

-

1

1

 10

 35

 31

 18

4

            Studiile de hibridare a ADN au fost utilizate pentru determinarea similarităţilor între specii. Metodele utilizate în aceste studii se referă la analiza spectrofotometrică a formării heteroduplexului şi la cele fluorometrice şi colorimetrice. [7]

            Tehnicile electroforetice utilizate în sistematica drojdiilor au creat posibilitatea realizării de studii la nivelul cromozomilor individuali. Multe specii de drojdii au o variaţie considerabilă ca număr şi dimensiune a ADN cromozomal.

1.1.1.   Aspecte de genetică moleculară

Ingineria genetică, sau în sens strict tehnologia ADN recombinant a revoluţionat rapid câteva domenii de bază în genetică şi biologia aplicată. În ultimii ani drojdia Saccharomyces cerevisiae a fost utilizată ca model experimental pe care s-a studiat expresia genelor din eucariotele superioare. În Figura 2 sunt prezentate schematic procedeele de bază în tehnologia ADN recombinant la drojdii.

            La tulpinile de drojdii industriale aspectele de genetică moleculară se referă la alegerea vectorilor, promotorilor, la selecţia markerilor şi la semnalele de secreţie. Aplicaţiile biotehnologice sunt dependente de clonarea genelor heteroloage pentru drojdii, izolate din ADN viral, procariote sau eucariote.

Figura 2. Procedeele de baza în ingineria genetica la drojdii.

            Numeroşi vectori plasmidiali au fost construiţi pentru transformarea genetică a celulelor de drojdie (Tabelul 2). În general pentru o transformare cât mai eficientă a celulelor de drojdie, vectorii trebuie să conţină:

-         secvenţe de plasmide bacteriene (E. coli), care servesc la producerea clonării şi amplificării şi care permit ca ADN să se insereze în celula gazdă;

-         secvenţă (ARS) care se  replică autonom;

-         secvenţă centromerică (CEN) pentru stabilitatea segregării mitotice;

-         markeri selectaţi corespunzător şi avantajos;

-         unul sau câteva situsuri pentru enzimele de restricţie, care permit inserarea ADN heterolog. [8]

Tabelul 2. Vectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie

Tipuri de vector

Exemple

Caracteristici

Plasmide de integrare

Plasmidă integrativă de drojdie (Ylp)

Frecvenţe scăzute de integrare în loci cromozomali prin recombinare homoloagă. Ylps sunt integrate în copii singulare, iar transformanţii sunt stabili, chiar în absenţa presiunii selective.

Plasmide de replicare independentă

Plasmidă replicativă de drojdie (YRp)

Frecvenţe înalte de transformare (500 – 2000 de transformanţi per ηg ADN) datorită elementelor ARS care menţin replicarea extracromozomală. Plasmidele sunt instabile pe timpul dezvoltării drojdiei datorită segregării asimetrice în diviziunea celulară. Yrps sunt utilizate rar.

Plasmidă epizomală de drojdie (YEp)

Acestea sunt derivate din plasmidele de 2 ηm din Saccharomyces cerevisiae cu origine în secvenţele de replicare. Yeps sunt relativ stabile, susţinute extracromozomal de 50 – 100 copii per celulă.

Plasmidele centromerice de drojdie (YCp)

Includerea secvenţelor centromerice (CEN) funcţionale de drojdie, conduce la segregarea stabilă în mitoză. Plasmidele sunt susţinute de 1 – 3 copii/celulă şi sunt stabile în diviziunea celulelor.

Plasmide specializate

Plasmidă lineară de drojdie (YLp)

Acestea sunt plasmide cromozomale artificiale care conţin secvenţe telomerice pentru susţinerea stagiului linear

Cromozomi artificiali de drojdie (YACs)

Cromozomi artificiali, lineari liberi sunt foarte stabili (conţin secvenţe CEN). Sunt utilizaţi pentru receptarea de inserţii libere de ADN, în analizele genomului uman, bogate în tehnici fizice curente

Plasmidă de expresie (YXp)

Conţine promotor transcripţional şi secvenţe terminale, de care genele heteroloage se pot lega. De asemenea, conţin secvenţe pentru modificarea şi secreţia proteinelor externe

Plasmide Killer

pGKL1 şi 2 din Kluyveromyces lactis sunt plasmide Killer lineare, care pot fi dezvoltate ca vectori de clonare

Plasmide de dezintegrare (YDp)

Utilizate pentru pierderea totală a secvenţei de vectori bacterieni.

 

            Promotorii sunt utilizaţi ca vectori de clonare în drojdii pentru mărirea transcripţiei genelor de interes. Secvenţele promotor care derivă din drojdii sunt (homoloage) sau heteroloage. Cei mai frecvenţi promotori constitutivi de drojdie sunt genele glicolitice care conduc la o expresie transcripţională înaltă. Enzimele glicolitice din celule de drojdie fermentate pot fi între 1 – 5% din totalul proteinei solubile, astfel că promotorii ADH, PGK şi ENO sunt cel mai remarcabili în mărirea activităţii transcripţionale a genelor heteroloage. Reglarea promotorilor este în primul rând facilitată de dezvoltarea celulei de drojdie în absenţa expresiei genei heteroloage. Pe de altă parte, creşterea biomasei poate fi temporar separată din expresia genei care controlează disponibilitatea pentru anumiţi nutrienţi (galactaza în cazul GAL1, fosfatul în cazul PHO5, metionina în cazul MET25 sauu ionii de cupru în cazul CUP1) (Tabelul 3).

Tabelul 3. Reglarea fiziologică a promotorilor transcripţionali în drojdii

Promotor

Reglare fiziologică

GAL1

PHO5

ADH2

MFa1

MFα1

CUP1

MEL1

MET25

Hibrid PGK/ARE

Hibrid CYC/GRE

PGK sau TPS/a 2 generator

HSE

AOX1

MOX1

Represat de glucoză, indus de galactoză

Represat de înalte şi indus de scăzute niveluri de fosfat anorganic

Represat de glucoză, derepresat natural către sfârşitul dezvoltării pe glucoză

Activ în celule MATa, inactiv în celule MATα sau a/α

Indus de şiftul de temperatură scăzut

Indus de ionii de Cu

Indus de galactoză, represat de glucoză

Represat de metionină

Indus de dihidrotestosteron

Indus de deoxicorticosteron

Indus de siftul de temperatură scăzut

Indus de şocul de căldură (390C)

Represat de glicerol, indus de metanol (în Pichia pastoris)

Represat de glicerol, indus de metanol (Hansenula polymorpha)

            Sifturile de temperatură pot fi, de asemenea, utilizate pentru reglarea expresiei genelor heteroloage în drojdie. [9]

            În mod particular activitatea transcripţională puternică a genelor heteroloage poate fi găsită în drojdiile metilotrofe Hansenula polymorpha şi Pichia pastoris. [10]

            Un alt aspect de genetică moleculară relevat cu succes de tehnologia ADN recombinant este selecţia markerilor corespunzători care sunt utilizaţi la izolarea şi identificarea celulelor transformante (Tabelul 4).

Tabelul 4. Selecţia markerilor genetici utilizaţi în tehnologia ADN recombinant la drojdii.

Tipul de marker

Gena

Caracteristici

Recesiv

LEU2

TRP1

HIS3

LYS2

Gene cu mutaţii auxotrofice complementare pentru biosinteza aminoacizilor

URA3

ADE2

Gene cu auxotrofie complementară pentru nucleotide

Amiloglucozidază

β - Lactanază

Gene care conferă activitate enzimatică

Dominant

CUP1

G418R

TUNR

KILK1

C230

SMR1

SFA

Rezistenţă la cupru.

Rezistenţă la antibiotic aminoglicozidic.

Rezistenţă la Tunicamicin.

Imunitate la toxina Killer.

Marker cromogenic.

Rezistenţă la metil sulfometuran.

Codifică formiat dehidrogenaza (celule care se dezvoltă în 6mM formaldehidă).

HygromicinR

MetotrexatR

CloramfenicolR

DiuzonR

ZeocinR

CanavaninăR

Gene care conferă rezistenţă la medicamente

            Markerii recesivi sunt gene care sunt complementare la o mutaţie auxotrofică specifică în tulpina de drojdie gazdă.Markerii specifici dominanţi sunt necesari pentru selecţia transformanţilor tulpinilor industriale de Saccharomyces cerevisiae.

            Elementele moleculare implicate direct în secreţia de proteine sunt secvenţele semnal ale capătului N – terminal din proteina destinată excreţiei. Aceste peptide semnal (formate din aproximativ 15 – 30 aminoacizi) care sunt îndepărtate de proteazele specifice, sunt codificate de către drojdii (native) sau de gene străine heteroloage, care sunt inserate în joncţiunea dintre partea finală a celui de-al 5’ şi 3’ promotor (Tabelul 5).

Tabelul 5. Secvenţele semnal utilizate pentru secreţia proteinelor heteroloage din drojdii.

Tip

Gena secvenţei semnal

Caracteristici

Homoloage

SUC2

PHO5

Toxină Killer

α - factor

MEL1

Codifică invertaza periplasmică

Codifică fosfataza acidă periplasmică din Kluyveromyces lactis

Prepro-Mfa1 leader este cel mai frecvent utilizat

Codifică melobioza şi secreţia de glicoproteină

Heteroloage

HSA

Codifică serumalbumina umană (HSA prepro a fost utilizat în Pichia pastoris)

 

Renină de Mucor pusillus

Lizozim de pui

Prolactin de bovine

Gastrin uman

 

Cele mai utilizate secvenţe semnal în Saccharomyces cerevisiae sunt cele derivate din invertază (codificată de SUC2), fosfatază acidă (PHO5) şi α - factor (MFa1). Specificitatea exopepdidazelor KEX2 şi STE13 este pentru secvenţele de pe N – terminal ale punctului de sciziune (Figura 3) α - factor leader a fost folosit cu succes direct în secreţia numeroşilor agenţi terapeutici umani [11].

Figura 3. Compoziţia şi procesarea α - factor leader în Saccharomyces cerevisiae.

            Procesul post – translaţional şi modificarea proteinelor recombinante de drojdie sunt  importante aspecte moleculare, care necesită o atenţie deosebită în special în ceea ce priveşte producerea de proteine terapeutice umane. Primul pas în procesul post – translaţional este îndepărtarea iniţiatorului de metionină din proteina astfel sintetizată de către metionilaminopeptidaza, care este un proces comun eucariotelor superioare. Modificările chimice pe care drojdiile le elimină odată cu proteinele heteroloage includ: glicozilarea, fosforilarea, acetilarea, metilarea, meristilarea şi izoprenilarea [[12] , [13] ].

            Sinteza şi totodată modificarea proteinelor heteroloage produse de către drojdii, suferă mai întâi o degradare proteolitică intracelulară, înaintea purificării lor. În Saccharomyces cerevisiae asemenea proteoliză poate fi unispecifică şi asociată cu vacuole sau poate fi specifică şi cuplată cu sistemul ubiquitin [[14] , [15] ].

1.2. Integritatea şi menţinerea genomului mitocondrial

            Instabilitatea genomului mitocondrial (ADNmt) este o problemă generală de la drojdii până la organismul uman. Oricum, controlul lui genetic nu este foarte bine cunoscut, cu excepţia de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. De la descoperirea, acum 50 de ani, a unor mutante petit de către Ephrussi şi colaboratori, s-a arătat că mai mult de 100 de gene nucleare influenţează direct sau indirect soarta rho+ din ADN mitocondrial [16].

            Nu este surprinzător că mutaţiile genelor implicate în metabolismul ADNmt (replicare, reparare, recombinare) pot cauza o pierdere completă a ADNmt (RHO0 petit) şi/sau conduc la formele reduse ale acestui genom. Oricum, cele mai multe pierderi ale funcţiei de mutaţie, care măresc instabilitatea ADNmt la drojdii, se comportă indirect prin implicarea în controlul diferitelor funcţii genetice, cum ar fi translaţia mitocondrială, sinteza ATP, homeostazia Fe, metabolismul acizilor graşi, morfologia mitocondriilor. În puţine cazuri s-a arătat că supraexprimarea genelor măreşte nivelurile mutantelor petit. Mutaţiile la alte gene sunt letale, în absenţa unui ADNmt funcţional, ceea ce transformă aceste drojdii petit pozitive în forme petit negative şi celulele petit nu pot fi recuperate în aceste contexte genetice. Multe dintre aceste date sunt explicate numai dacă una dintre ele presupune că păstrarea genomului rho+ depinde de o structură asemănătoare centromerului, indispensabilă pentru menţinerea ADNmt rho+ şi/sau a funcţiei subunităţilor de sinteză a ATP codificate mitocondrial, în special ATP6.

1.3. Căile MAP – kinazei la drojdia Saccharomyces cerevisiae

            Un set de 3 protein – kinaze, cunoscute ca MAPK (protein kinaza mitogen activată), este întâlnită în mod curent ca parte a căilor de semnalizare în celulele eucariote. Aproape două decenii de experienţe în domeniul geneticii şi biochimiei, plus completarea recentă a hărţii genetice a Saccharomyces cerevisiae au adus la iveală doar 5 seturi MAPK funcţionale şi distincte la această drojdie [17].

            Conjugarea sexuală, creşterea celulară şi adaptarea la stres, de exemplu, toate acestea necesită răspunsurile celulare mediate de MAPK. O principală funcţie a acestor seturi pare a fi expresia genelor, ca răspuns la semnalele extracelulare sau ca parte a proceselor de dezvoltare specifice. Seturile MAPK deseori par a regla ciclul celular şi invers.

            În ciuda succesului erei ingineriei genetice, în descoperirea acestor căi există încă multe lipsuri importante despre mecanismele moleculare ale activării acestor cascade, a modului cum aceste cascade reglează funcţiile celulei. De exemplu, comparaţia căilor de semnalizare specifice diferitelor drojdii a scos la iveală o varietate foarte mare a diferitelor tipuri de proteine semnalizatoare, a căror funcţie activează MAPK. Totuşi modul de activare de către aceste proteine a MAPK, rămâne neclar.

            Ştim, de asemenea, că toate căile MAPK ale drojdiei se reglează reciproc şi interacţionează cu alte căi de semnalizare pentru a produce un model de exprimare coordonat a genelor, dar mecanismul molecular al acestuia este foarte puţin cunoscut.

1.4. Prionii din Saccharomyces cerevisiae şi Podospora sp.

            Studiile genetice au arătat că 2 elemente genetice non – mendeliene la Saccharomyces cerevisiae, numite (URE3) şi (PSI)  sunt prionii lui Ure2p şi respectiv Sup35p. (URE3) face ca celula să se prerepreseze pentru catabolismul azotului, în timp ce (PSI) ridică eficienţa supresorului ARNts. Aceeaşi abordare a dus la identificarea elementului non – mendelian (Het-s) al fungului filamentos Podospora anserina, ca prion al proteinei het – s. Forma prionică a proteinei het-s este cerută pentru incompatibilitatea heterocarionului, o funcţie normală a fungului, ceea ce sugerează că alte funcţii celulare normale pot fi controlate de prioni. (URE3) şi (PSI) implică o autopropagare şi agregarea Ure2p şi Sup35p. In vitro Ure2p şi Sup35p, formează amiloida, o structură filamentoasă, cu o pată birefrigentă verde caracteristică, pusă în evidenţă cu Roşu de Congo. Depozitele amiloidice sunt de o importanţă mare pentru viitorul descoperirii unui leac împotriva bolii Alzheimer, a transmiterii encefalopatiei spongiforme şi a multor altor boli [18].


[1] Spencer, I., Spencer, D., Yeasts Technology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York, 3-65, (1994).

[2] Walker, M. G., Yeast Physiology and Biotechnology, Wiley I. and Sons, 264-319, (1988).

[3] Berry, D. R., Russell, I. and Steward G. G., Yeast Biotechnology, Allen and Unwin, London, (1987).

[4] Lodder, J., The Yeasts, North Holland Publ. Co, amsterdam, (1970).

[5] Wolf, K., Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York, (1996).

[6] Prillinger, H., Oberwinkler, F., Umile, C., Bauer, R., Gen. Appl. Microbiol., 39, 1-34, (1993).

[7] Kutzman, C. P., Methods Enzymol, 224, 335-348, (1993).

[8] Hinnen, A., Buxton, F., Chandhuri, B., Hein, I., Hottinger, T., Meyhack, B., Pohlig, G., Gene expression in recombinant micro-organism, A. Smith, Marcel Dekker Inc., New York, 121-193, (1995).

[9] Piper, P.W., Kirk, N., Genetically Engineered Proteins and Enzymes from yeasts, Production Control, A. Wiseman, Ellis Horword, Leichester, UK, 147-189, (1991).

[10] Faber, K. N., Horder, W., Ab. G., Vecnhuis, M., Yeast, 11, 1331-1344, (1995).

[11] Brake, A. I., Yeast Genetic Engineering, P. J. Barr, A. J. Brake and P. Valenzuela, Butterwarths, Boston, 269-280, (1989).

[12] Hinnen, A., Buxton, F., Chandhuri, B., Hein, I., Hottinger, T., Meyhack, B., Pohlig, G., Gene expression in recombinant micro-organism, A. Smith, Marcel Dekker Inc., New York, 121-193, (1995).

[13] Exhart, M. R., Bussineau, C. M., Current opinion in Biotechnology, 7, 525-530, (1996).

[14] Hinnen, A., Buxton, F., Chandhuri, B., Hein, I., Hottinger, T., Meyhack, B., Pohlig, G., Gene expression in recombinant micro-organism, A. Smith, Marcel Dekker Inc., New York, 121-193, (1995).

[15] Hilt, W., Wolf, D. H., Molecular Microbiology, 6, 2437-2442, (1992).

[16] Luttik, M. A. H., Overkamp, P., J. Biol.Chem., 273, 24529-24534, (1998).

[17] Stephanopoulos, G., Aristodon, A., Nielsen, J., Metabolic engineering, academic Press, Inc. San Diego, Calif., (1998).

[18] Lindquist, G., Molecular Psychiatry, 1, 376-379, (1996).

<< Pagina precedentã | Despre autori | Cuprins | Home | Pagina urmãtoare>>
© Universitatea din Bucuresti 2002. All rights reserved.
No part of this text may be reproduced in any form without written permission of the University of Bucharest, except for short quotations with the indication of the website address and the web page.e University of Bucharest, except for short quotations with the indication of the website address and the web page.
Comments to:Ioan Florea Dumitru Last update: October 2002     Web design§Text editor: Monica CIUCIU