6. Lipide microbiene

6.1. Introducere

            Este cunoscut de mult timp faptul că microorganismele sunt capabile să producă lipide. Pentru a se păstra analogia cu plantele din care se extrag uleiurile, aceste microorganisme au fost denumite oleaginoase. Doar uleiurile foarte valoroase pot fi obţinute prin procese biotehnologice, deoarece în cazul uleiurilor obişnuite, preţul de cost este superior produselor similare obţinute prin procedeele clasice.

            Piaţa comercială a uleiurilor vegetale continuă să fie dominată de uleiul de soia (producţia mondială în 1993 18·10⁶ t faţă de 6·10⁶ t în 1983) [[1] ]. Preţul untului de cacao a variat între 3000 şi 8000 $ S.U.A. per tonă (vrac). Menţinerea unui preţ pe tonă în jurul valorii maxime face ca metodele biotehnologice să de obţinere a triacilglicerolilor să devină promiţătoare, mai ales în cazul utilizării ca sursă de carbon a apelor reziduale din diverse industrii.

            O altă oportunitate pentru procesele biotehnologice o constituie uleiurile utilizate în îngrijirea sănătăţii cum ar fi uleiurile polinesaturate. Dintre acestea trebuie menţionate acidul γ-linoleic (18:3 ω-6), acidul arachidonic (20:4 ω-6), acidul eicosapentanoic (20:5 ω-3), etc [[2] ].

            Lipidele cu valoare foarte ridicată sunt compuşi prostanoidici cum ar fi prostaglandinele, leukotrienele şi tromboxanii, folosiţi în special în scopuri terapeutice experimentale. Ţinând seama de utilizările acestor compuşi cantităţile necesare sunt de ordinul câtorva kg/an.

6.2. Scurt istoric

Prima referinţă la uleiurile microbiene apare în lucrarea lui Nägeli şi Loew „Uber die Chemische Zussammensetzung der Hefe“ publicată în 1878 [[3] ]. Prima fracţionare a unui amestec de lipide microbiene a fost realizată de Hinsberg şi Roos în 1903. Ei au identificat un acid gras saturat cu formula C₁₅H₃₀O₂ (probabil un amestec de acizi miristic şi stearic) alături de doi acizi nesaturaţi din care unul era acidul oleic, iar celălalt un acid gras C₁₂. „Colesterolul“ sau mai probabil ergosterolul a fost de asemenea identificat în lipidele extrase.

            Prima biotehnologie de obţinere a grăsimilor şi uleiurilor din Torula a fost realizată de Lindner la Berlin în 1890. Procesul a fost dezvoltat la scară pilot în 1914-1918 cu Trichosporon pullulans în încercarea de a găsi o sursă alternativă de grăsimi în timpul primului război mondial.

            Conceptele dezvoltate de Lindner au stat la baza elaborării biotehnologiilor de obţinere a uleiurilor şi grăsimilor microbiene. Este demn de menţionat faptul că în 1937 Fink a ajuns la concluzia că obţinerea industrială a lipidelor microbiene este neatractivă în viitorul apropiat. Odată cu izbucnirea celui de-al doilea război mondial cercetarea în acest domeniu a fost din nou intensificată în Germania în cadrul a două companii Zellstoff Fabrik în Maaheim-Waldorf şi Henkel et Cie GmbH în Dusseldorf. Prima companie şi-a orientat eforturile către Candida utilis în timp ce ultima s-a concentrat asupra genului Fusarium. În această perioadă s-a făcut şi trecerea de la cultura de suprafaţă la cultura submersă. Nici unul din aceste procese nu a constituit un succes deplin, producându-se doar cantităţi mici de grăsimi microbiene ce au fost folosite în hrana cailor.

            Dificultăţile întâmpinate în dezvoltarea tehnologiilor pentru obţinerea grăsimilor microbiene au fost în principal de natură tehnică, deoarece nu exista o tehnologie eficientă pentru producerea unor cantităţi mari de biomasă bogată în grăsimi.

            Această problemă a putut fi depăşită în momentul dezvoltării biotehnologiilor pentru obţinerea antibioticelor în cultură submeră şi apoi a proteinelor monocelulare.

            Prof. F.Lynen a primit premiul NOBEL pentru chimie în 1964 pentru studiile legate de biosinteza lipidelor microbiene [7].

6. 3. Microorganismele producătoare     

Principalele microorganisme producătoare de lipide microbiene sunt eucariote (alge, drojdii şi fungi), deşi au fost identificate şi câteva bacterii cu conţinut ridicat de lipide. Bacteriile acumulează în special ceruri şi poliesteri.

Tabelul 1. Distribuţia acizilor graşi din câteva drojdii.

Deşi  conţinutul de grăsimi (raportat la substanţa uscată) atinge 70% pentru unele drojdii fiind chiar mai mare pentru câteva ciuperci, unul din factorii cheie ai realizării unui bioproces atractiv economic îl constituie randamentul de transformare a substratului în lipide. În această privinţă drojdiile sunt superioare fungilor. Randamentul teoretic de transformare a unui substrat de tipul glucozei într-o substanţă de tipul trioleinei este aproximativ 33% (g/g), presupunând că nu se formează alte componente celulare. Cum celula microbiană conţine şi proteine, acizi nucleici şi glucide, randamentul real este mult mai redus. În cazul fungilor, au fost rareori semnalate randamente mai mari de 18-20%, în timp ce pentru drojdii randamentele de transformare depăşesc în mod normal 20% (26% pentru Candida curvata) cu o medie de 22-23% atunci când sursa de carbon este glucoza, lactoza, xiloza sau zaharoza. Au fost obţinute randamente mai mari când s-a utilizat ca sursă de carbon etanolul.

Tabelul 2. Raporturile procentuale dintre acizii graşi nesaturaţi sintetizaţi de unele specii de fungi.

^a acid γ-linolenic, 18:3 (6,9,12)

Cea mai mare productivitate s-a obţinut utilizând sistemul de cultivare continuă. Cultivarea drojdiilor în sistem continuu este mai simplă decât în cazul fungilor şi de aceea este preferat. Totuşi, ţinând seama de spectrul larg de acizi graşi ce pot fi obţinuţi şi în special de posibilitatea obţinerii acizilor graşi cu catenă mai scurtă prin cultivarea fungilor, aceştia nu pot fi eliminate din competiţie. Unele specii din familia Enthomophorales pot produce acizi graşi ≤C14 până la 70% din conţinutul total de acizi graşi. Principalul dezavantaj constă în distribuţia largă a catenei (C8-C14). Fungii din familia Phycomycete pot produce acizi graşi polinesaturaţi.

           În literatură există numeroase date privind cultivarea drojdiilor în sistem continuu sau fed-batch în scopul obţinerii lipidelor microbiene. În ultimul caz, utilizându-se drojdia Lipomyces starkeyi pe substrat etanol s-a obţinut o concentraţie celulară de 154 (g/l) cu un conţinut de lipide de 54%.

6. 4. Acumularea lipidelor

            Deşi ca orice organism viu şi microorganismele conţin întotdeauna lipidele necesare funcţionării membranelor, nu toate microorganismele pot fi considerate surse de lipide.

            Practic, sunt denumite oleaginoase, microorganismele ce conţin peste 20-25% lipide. Boulton şi Ratledge [[4] , [5] ] au corelat capacitatea de acumulare a lipidelor cu activitatea citrat liazei, enzimă din ciclul ATP care participă la formarea acetil CoA din citrat conform ecuaţiei globale:

            Activitatea citrat liazei reprezintă un indicator foarte important asupra capacităţii unui microorganism de a acumula lipide, cu atât mai mult cu cât citrat liaza nu este prezentă în drojdiile neoleaginoase şi nici în cazul tulpinilor neoleaginoase ale unor specii cărora le aparţin şi tulpini oleaginoase cum ar fi Lipomyces starkeyi şi L. lipofer.

            Din 600 de specii de drojdii, numai 25 sunt capabile să acumuleze mai mult de 20% lipide, iar din cele 60.000 de specii de fungi doar 50 acumulează mai mult de 25%.

Spectrul acizilor graşi care apar în drojdii este mult mai îngust decât cel al acizilor graşi din bacterii, neexistând acizi graşi cu catenă ramificată. Doar câteva specii de drojdii (în special cele din genul Torulopsis) produc hidroxiacizi graşi. Acizii graşi (Tabelul 2 ) au de obicei 16-18 atomi de carbon. Drojdiile ca şi alte organisme eucariote îşi sintetizează acizii graşi nesaturaţi pe calea acidului oleic, care de obicei este cel mai abundent în celulă.

Drojdiile produc şi acizi graşi polinesaturaţi, deşi S.cerevisiae nu poate produce nici acid cis,cis-linolenic, 18: (9,12), nici acid a-linolenic, 18:3 (9,12,15) care apar în cele mai multe din celelalte drojdii.

Toţi acizii graşi sintetizaţi de drojdii au fost identificaţi şi în lipidele din plante. În toate microorganismele, acizii graşi sunt esterificaţi sub forma triacilglicerolilor, fosfolipidelor, etc. Principala formă de stocare a lipidelor în organismele eucariote este reprezentată de triacilgliceroli. Distribuţia acizilor graşi în esteri este aceiaşi cu cea din uleiurile vegetale, însă se constată absenţa aproape totală a acizilor saturaţi C16 şi C18 în poziţia sn-2. Structura resturilor acil legate în celelalte două poziţii a fost mai puţin studiată. În lipidele din Lipomyces lipofer în poziţiile sn-1 şi sn-3 au fost identificaţi acizii 16:0, 18:1 şi 18:2.

În schimb, fosfolipidele din drojdii au fost intens studiate. Cele mai importante (ţinând seama de ordinea răspândirii) sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinozitol şi fosfatidilserina. Din S.cerevisiae au fost izolate cadiolipina (Figura 1) şi lisofosfatidilcolina (care are în locul grupării acil din poziţia sn-2 o grupare hidroxil liberă).

Sterolii sunt de asemenea prezenţi în drojdii. Cei mai des întâlniţi sunt ergosterolul şi zimosterolul (Figura 2) alături de numeroşi alţi steroli în cantităţi mai mici. Sterolii pot apărea liberi sau esterificaţi cu un acid gras în poziţia 3-hidroxi. De asemenea, din drojdii a fost izolat şi squalenul, hidrocarbura C₃₀ precursoare a sterolilor.

Drojdiile, în special cele aparţinând genurilor Rhodotorula, Cryptococcus şi Sporobolomyces, produc o varietate de pigmenţi carotenoizi galbeni (β-caroten) sau roşii (torularodin) ceea ce face ca mediul de fermentaţie să fie colorat. Astaxantina este responsabilă pentru culoarea roz-flamingo a Phaffia rhodozyma (Figura 3).

În culturile de drojdii apar ca lipide extracelulare sfingolipidele de tipul ceramidei şi glicolipidele.

Au fost de asemenea separaţi diferiţi derivaţi acilaţi ai manozei, arabitolului, xilitolului şi soforozei. Grupările acil sunt de obicei hidroxi acizi de tipul 16:0 (3-OH), 18:0 (3-OH), 22:0 (13-OH), 18:0 (17-OH), sau polihidroxiacizi cum ar fi acidul 8,9,13-trihidroxidocosanoic cu diverse grade de acetilare şi acilare.

Pentru acumularea lipidelor în microorganismele oleaginoase acestea sunt cultivate într-un mediu cu un raport mare C/N. După primele 24 de ore de creştere echilibratǎ, când nutrienţii se aflǎ în exces, sursa de azot (de obicei NH₄⁺) este consumată integral. În aceastǎ perioadǎ nu are loc nici-o acumulare de lipide. După o perioadǎ de aproximativ 6 ore când rezerva de azot a celulei (formatǎ în cea mai mare parte din amino acizi) este consumatǎ, biosinteza proteinelor şi acizilor nucleici încetează complet, dar sursa de carbon continuă să fie asimilată în continuare. Prin transformarea zaharurilor în lipide, celula se va umfla cu picături de lipide [[6] ] şi astfel va deveni „obeză“ asemănător animalelor superioare (Figura 4).

Acumularea lipidelor în drojdii corespunde deci unui model cinetic bifazic şi nu este legată de creşterea celulară. În cazul fungilor, care au o viteză specifică de creştere mai redusă , viteza de creştere a biomasei coincide cu viteza de acumulare a lipidelor (Figura 5).

Epuizarea altor nutrienţi Mg²⁺, PO4^3- (cu excepţia carbonului şi oxigenului) poate determina de asemenea acumularea lipidelor, dar înmulţirea celulelor este cel mai uşor influenţată de sursa de azot.

Utilizând un mediu de cultură cu raport C:N 50:1 Ratledge [1, 3] a reuşit obţinerea biomasei cu conţinut mare de lipide la o diluţie de 25-30% din viteza specifică maximă de creştere (Figura 6). În aceste condiţii, concentraţia de azot este practic zero, iar organismul are un timp de staţionare suficient pentru a asimila excesul de carbon şi a-l transforma în lipide.

            Iniţial s-a considerat că raportul exact C:N ales pentru mediul de cultură este de mică importanţă cu condiţia ca azotul să fie nutrietul limitativ şi să existe suficient carbon pentru a permite o bună acumulare a lipidelor. Cu toate acestea, s-au obţinut randamente diferite în lipide cu drojdia Apiotrichum curvatum, în cultivare continuă prin variaţia raportului C:N în mediul de creştere.

            Între raportul carbon azot şi viteza maximă de creştere (diluţie) pe care organismul o poate atinge există o relaţie de tipul unei curbe hiperbolice; cea mai scăzută viteză de creştere s-a atins la cel mai mare raport C:N (50:1), ceea ce determină cantitatea de lipide produsă şi eficienţa transformări exprimată ca [g lipide/g glucoză folosită].

Concentraţia maximă de lipide în celulă ( 50% g/g) s-a obţinut la un raport C:N de 50: sau mai mare, proporţia optimă pentru o productivitate maximă (g lipide/l/h) a fost de 25:1, atunci când sursa de carbon a fost glucoza şi de 30-35:1 atunci când s-a utilizat zerul. Rezultate similare au fost obţinute şi cu tulpina Rhodotorula glutinis.

S-a observat că în cazul tulpinii Apiotrichum curvatum are loc o acumulare simultană în celulă de 50% lipide şi aproximativ 20% zaharuri. Acumularea zaharurilor este datorată unei întârzieri în sinteza lipidelor după iniţierea asimilării sursei de carbon.

La Apiotrichum curvatum a fost identificat polizaharidul care s-a acumulat ca fiind glicogenul. În ipoteza că s-ar putea preveni biosinteza polizaharidului care este ca şi lipidele o substanţă de rezervă, atunci teoretic s-ar putea creşte cantitatea totală de lipide produsă în celulă.

6. 5. Biochimia formării lipidelor în microorganismele oleaginoase

Studiile experimentale au demonstrat că drojdiile oleaginoase nu diferă de alte drojdii în ceea ce priveşte consumul de glucoză, turn-over-ul lipidelor sau activitatea acetil-CoA carboxilazei –prima enzimă în biosinteza acizilor graşi-. Au fost observate diferenţe în ceea ce priveşte reglarea ciclului acidului citric şi producerea acetil-CoA. Spre deosebire de alte drojdii care transformă excesul de sursă de carbon în polizaharide de rezervă, drojdiile oleaginoase metabolizează sursa de carbon sintetizând lipide [[7] ].

            Din punct de vedere structural, acetil-CoA carboxilaza este o enzimă complexă: au fost identificate 3 componente funcţionale şi anume biotin proteina transportoare de carboxil (BCCP), biotin carboxilaza şi carboxil transferaza [[8] ].

Deci enzima catalizează carboxilarea acetil-CoA, pentru a sintetiza malonil –CoA, reacţia având loc în două etape (2+3) fiind dependentă de prezenţa ATP.

Pentru reglarea activităţii enzimei au fost propuse mai multe mecanisme: activarea prin intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici, inhibiţia prin esterii acil-CoA cu acizi graşi cu catenă lungă, sau fosforilarea reversibilă.

Este posibilă de asemenea activarea allosterică a acetil-CoA carboxilazei prin citrat. Un alt mecanism de reglare a fost propus pe baza observaţiei că esterii acil-CoA cu catenă lungă inhibă acetil CoA carboxilaza din diverse surse. Este însă posibil ca acţiunea inhibitoare a acestor esteri să fie nespecifică, datorându-se proprietăţilor lor tensioactive.

Malonil-CoA, obţinută din reacţia acetil-CoA carboxilazei, este folosită în sinteza acizilor graşi saturaţi cu catenă lungă printr-o serie de reacţii care necesită NADPH şi acetil-CoA, catalizate de complexul acid gras sintetază. Structura complexului enzimatic este diferită în funcţie de sursa de provenienţă, dar secvenţa reacţiilor este în principiu similară pentru toate organismele:

Deoarece produsul final din ecuaţia (9) devine substrat în ecuaţia (6) unde reacţionează cu o altă moleculă de malonil-S-enzimă, rezultatul concret al fiecărui ciclu de reacţii este introducerea a doi atomi de carbon suplimentari în gruparea acetil iniţială. Aceşti atomi de carbon suplimentari sunt ei înşişi obţinuţi din acetil-CoA substrat al acetil CoA carboxilazei. După 7 repetări ale ciclului, este sintetizată palmitoil-CoA cu următoarea stoechiometrie:

Natura produşilor finali din complex este determinată într-o mare măsură de specificitatea de substrat a β-cetoacil-sintazei. De exemplu, propionil-CoA poate înlocui acetil CoA în reacţia de iniţiere, ceea ce are drept consecinţă sintetizarea acizilor graşi cu număr impar de atomi de carbon. Acid gras sintetazele din microorganismele eucariote sunt organizate structural şi funcţional în complecşi nedisociabili. Aceste sintetaze numite de tip I constau din copii multiple a doar două polipeptide multifuncţionale. Prezenţa proteinei transportatoare de acil a fost confirmată în sintetazele de tip I prin detectarea 4-fosfopantoteinei care este gruparea prostetică a proteinei transportatoare de acil.

Scindarea citratului pare a fi etapa determinantă de viteză în biosinteza lipidelor, fiind supusă inhibiţiei prin feed-back de către esterii graşi ai acetil CoA. Transportul citratului în afara mitocondriilor este şi el inhibat de aceşti compuşi, cele două etape (transportul şi scindarea citratului) fiind intim legate.

Acetil CoA rezultată prin scindarea citratului constituie substratul pentru biosinteza acizilor graşi. Unele studii indică existenţa unei activări a acetil CoA de către citrat ceea ce are importanţă fiziologică întrucât concentraţiile de citrat în drojdiile oleaginoase sunt mai mari decât în cele neoleaginoase.

Aşa cum se poate observa din Figura7, un alt produs al ciclului este oxaloacetatul. Acesta este transformat în malat care devine contranion pentru transportul citratului. Malatul mitocondrial este retransformat în oxaloacetat, asigurându-se astfel unul din cele două substraturi necesare sintezei citratului. Sinteza citratului nu pare a fi un proces care să necesite adaptarea la anumite condiţii.

Malatul este necesar pentru asigurarea ieşirii citratului din mitocondrii. Malatul necesar pentru iniţierea procesului este produs din piruvat prin acţiunea enzimei malice. Deşi iniţial s-a crezut că această enzimă ar cataliza transformarea malatului în piruvat, ea acţionează în ambele sensuri.

6. 6. Factorii care influenţează biosinteza lipidelor

            Sunt mulţi factori care afectează compoziţia lipidelor intracelulare şi astfel pot provoca o creştere sau o scădere a cantităţii totale de lipide intracelulare. Pentru că aproape orice schimbare în condiţiile de creştere ale microorganismului poate determina o variaţie în compoziţia lipidelor, este necesar să se ţină seama de succesiunea de evenimente care se produc la variaţia unui singur parametru în timpul cultivării discontinue. De exemplu, în cazul influenţei temperaturii asupra gradului de nesaturare al grupărilor acil grase din lipide, trebuie să se ţină seama că o scădere a temperaturii va încetini viteza de creştere a organismului şi simultan va duce la creşterea cantităţii de oxigen dizolvat în mediu. Aceste variaţii ale condiţiilor de cultivare ar putea să influenţeze starea metabolică a celulelor ceea ce poate determina scăderea sau creşterea pH, necunoscându-se care dintre aceste schimbări semnalizează efectul variaţiei temperaturii.

            Influenţa vitezei de creştere asupra acumulării lipidelor în microorganismele oleaginoase este un factor determinant major al cantităţii de lipide care se acumulează intracelular (Figura 6), deşi în organismele eucariote neoleaginoase efectul pare să fie mai puţin evident.

            Cele mai multe experimente s-au făcut cu drojdii şi majoritatea cu glucoză, uneori cu metanol sau etanol. Glucoza, a cărei metabolizare urmează calea Embden-Meyerhof, pune cele mai multe probleme pentru microorganismele eucariote, care din acest punct de vedere sunt clasificate ca fiind Crabtree pozitive sau Crabtree negative. Pentru microorganismele Crabtree pozitive, o creştere a concentraţiei de glucoză sau orice alt zahar metabolizat pe calea glicolitică are ca rezultat o represie a sintezei enzimelor oxidative (respiratorii) şi se manifestă printr-o scădere a consumului de oxigen cuplată cu acumularea de intermediari metabolici reduşi, cum este etanolul. S.cerevisiae este o drojdie tipic Crabtree pozitivă; o creştere a concentraţiei de glucoză va determina astfel o mărire a producţiei de etanol chiar în condiţii aerobe. Schimbările metabolice sunt asociate probabil cu o scădere a componentelor mitocondriale ceea ce conduce la o scădere generală a sumei acizilor graşi, glicerofosfolipidelor şi sterolilor esterificaţi.

            La drojdiile Crabtree negative, cum sunt Candida utilis şi Saccharomyces fragilis, se constată o creştere a lipidelor acumulate pe măsură ce concentraţia de glucoză creşte. Creşterea cantităţii de lipide se manifestă în principal sub forma triacilglicerolilor.

Tabelul 3. Acizii graşi din drojdiile consumatoare de metanol.

            În cazul drojdiilor consumatoare de metanol care sunt facultativ metilotrofe, apar variaţii mari în ceea ce priveşte spectrul de acizi graşi faţă de drojdiile crescute pe glucoză (Tabelul 3 ).

            În cazul a două drojdii crescute pe metanol s-au constatat modificări importante în compoziţia fosfolipidelor: au crescut fosfatidil serina şi fosfatidil inositolul pe seama fosfatidil colinei [[9] , [10] ].

            Experimente efectuate în cultivare fed-batch au demonstrat influenţa substratului asupra corelaţiei dintre concentraţia celulară şi conţinutul de lipide. Astfel, cu tulpina Lipomyces starkeyi cultivată pe substrat etanol s-a obţinut o concentraţie a biomasei de 150 g/l şi un conţinut de lipide de 54%. Folosind tulpina Rhodotorula glutinis pe glucoză în cultivare fed-batch a fost obţinută o concentraţie de biomasă de 181 g/l cu un conţinut de 43% lipide. În aceste cazuri, creşterea a trebuit să fie susţinută prin utilizarea de aer îmbogăţit cu oxigen (40% oxigen). Pare posibilă atingerea unor concentraţii celulare de 100 g/l şi fără a folosi oxigen suplimentar, cu cele mai multe dintre drojdiile oleaginoase.

           În general, gradul de nesaturare al acizilor graşi din sistemele biologice creşte pe măsură ce temperatura de cultivare scade, observaţie valabilă atât pentru organismele procariote [[11] ] cât şi pentru cele eucariote [[12] ]. Atunci când studiile s-au desfăşurat în chemostat, corelaţia dintre gradul de nesaturare şi temperatură a fost confirmată în multe cazuri. Dar nu toate organismele prezintă acest comportament; s-au constatat diferenţe puţin semnificative în gradul de nesaturare al acizilor graşi la Saccharomyces cerevisiae între 30 şi 15 ^oC [[13] ]; la Candida sp. 107, între 19 şi 32,8 [[14] , [15] ], sau la Rhodotorula gracilis între 22,5 şi 30^oC.

Schimbările care apar în gradul de nesaturare şi chiar în scurtarea lungimii catenei acizilor graşi, care determină o creştere a fluidităţii lipidelor din membrană la temperaturi mai joase, sunt explicabile fie prin inducerea diferitelor reductaze la temperaturi mai joase, fie prin modificările ce apar în activitatea acid gras sintetazei [[16] ].

            La eucariote, oxigenul este necesar pentru transformarea acidului stearic în acid oleic şi apoi în acizi linoleic şi linolenic. Deoarece există o singură etapă în biosinteza acizilor graşi care necesită ATP şi nici una care să necesite oxigen direct, este de aşteptat ca lipsa oxigenului să nu conducă la scăderea conţinutului de lipide din celule, fiind afectat doar randamentul în biomasă.

Doar la valori extreme de pH şi salinitate este influenţată vizibil compoziţia lipidelor. În mod obişnuit, membranele altor microorganisme decât cele acidofile, alcalinofile sau halofile, nu sunt în stare de modificări care să le permită să supravieţuiască în astfel de condiţii.

Aşa cum s-a menţionat anterior, limitările altor nutrienţi cum ar fi Mg²⁺, PO₄^3- pot determina creşterea cantităţii de lipide acumulate, dar pot de asemenea conduce la modificări ale compoziţiei lipidelor în mod independent de efectul asupra lor asupra acumulării lipidelor. De exemplu, limitarea prin fosfat determină la S.cerevisiae scăderea cantităţii de sterol esterificat şi a triacil glicerolilor, independent de cantităţile de fosfolipide [[17] ].

            Deficienţa inositolului la anumite tulpini de S.carlsbergensis şi S.cerevisiae, conduce la o creştere a cantităţii de lipide celulare [[18] ]. Se consideră că acest efect este datorat unei creşteri a activităţii acetil-CoA carboxilazei, deşi nu se cunoaşte exact mecanismul prin care acumularea lipidelor este influenţată de deficienţa de inositol.

            Pe de altă parte, deficienţa de tiamină conduce la S.carlsbergensis la o scădere a cantităţii totale de lipide: sterol esterificaţi, acil gliceroli, glicofosfolipide [[19] ].

6.7. Consideraţii tehnico-economice

Evaluarea potenţialului pentru obţinerea uleiurilor şi grăsimilor microbiene s-a concentrat asupra posibilităţii utilizării apelor reziduale ca sursă de carbon pentru obţinerea biomasei cu conţinut ridicat de ulei. Astfel, zerul din industria laptelui rămas după îndepărtarea proteinelor conţine 5,5% lactoză şi reprezintă o sursă de carbon ieftină pentru cultivarea drojdiilor oleaginoase. Creşterea drojdiei Candida curvata D (Apiotrichum curvatum ATTC 20509) a permis obţinerea unei biomase cu 20%(g/g) ulei cu o compoziţie apropiată de cea a uleiului de palmier (25% 16:0; 15% 18:0; 49% 18:1; 7,5% 18:3). A fost investigată de asemenea posibilitatea utilizării xilozei, xilanului şi a apelor reziduale din industria lemnului ca substrat pentru dezvoltarea biomasei. Acestea conţin aproximativ 40% (g/g) hemiceluloză, -restul fiind celuloză şi lignină-  (raportate la substanţa uscată) alcătuită în principal din xilan. Xilanul sau xiloza (produsul de hidroliză al acestuia) sunt la fel de eficiente ca glucoza pentru obţinerea biomasei. S-au obţinut 13,7 g triacilgliceroli din 100g xiloză. Xiloza şi xilanul sunt materii prime potenţiale ieftine şi abundente, care îşi pot găsi întrebuinţarea nu numai în obţinerea uleiurilor , dar şi pentru alte produse biotehnologice.

Calculul economic al proceselor de fermentaţie nu este în favoarea obţinerii biomasei bogate în uleiuri, dacă se ia în considerare o transformare a substratului în lipide de numai 20%, aşa cum s-a obţinut în Europa şi America de Nord. Costurile de fermentaţie sunt de cel puţin 1000 DM/ tona de biomasă, ceea ce înseamnă aproximativ 2500 DM / tona de ulei, la un conţinut de ulei în biomasă de 40%; la acesta se adaugă costurile de prelucrare a biomasei şi preţul substratului, ceea ce conduce la un cost total de 5000DM/ tonă. Acest cost mai poate fi micşorat dacă deşeurile celulare bogate în grăsimi pot fi vândute ca hrană pentru animale. In această alternativă se pot lua în considerare următoarele costuri: 2 tone substrat – 800 DM; costurile de fermentaţie şi prelucrare: 1500 DM

Costul total al unei tone de produs care conţine 40% ulei şi 60% resturi celulare, ar fi de 2300 DM. In condiţiile în care conţinutul în proteină al resturilor celulare este de 40-45%, acestea se pot folosi ca aditiv furajer, care se poate vinde cu 500 DM/ tonă . Deci din preţul total al unei tone de produs de fermentaţie se pot scădea 300 DM, obţinute din folosirea resturilor celulare ca aditivi furajeri proteici, ceea ce conduce la un cost net de 2000 DM pentru o tonă produs de fermentaţie cu 40% conţinut în uleiuri, ceea ce înseamnă 5000DM/ tonă de ulei.

Totuşi cea mai mare contribuţie la scăderea preţului o are micşorarea considerabilă a costului substratului. Ţinând cont de aceste considerente, procesele de obţinere a biomasei bogate în uleiuri care folosesc ca substrat xilanul sau zerul sunt foarte atractive.

Variantele pentru obţinerea economică de biomasă bogată în uleiuri este fie producerea de uleiuri sau grăsimi cu valoare mare de vânzare (5000 DM/ tonă sau mai mult) sau utilizarea unor substraturi ieftine sau chiar subproduse poluante rezultate în alte procese tehnologice.

Biomasa bogată în uleiuri este o variantă mult mai avantajoasă din punct de vedere economic decât proteinele monocelulare, pentru care se opta ca variantă de produs biotehnologic într-un procedeu de reciclare. Biomasa bogată în uleiuri are în primul rând avantajul faţă de proteinele monocelulare de a nu fi folosită ca produs destinat consumului alimentar uman, ceea ce permite utilizarea ca substraturi a unor produse cu costuri zero sau chiar negative, cum ar fi resturile menajere, efluenţii poluanţi din diverse procese de producţie, care nu se pot recircula. Probabil că pot fi folosiţi chiar efluenţi de la fabricile de producere a uleiurilor sau grăsimilor.