7. Aplicaţii terapeutice ale produselor biotehnologice probiotice

Introducere

           Probioticele în produse alimentare şi farmaceutice au apărut pe piaţă în cursul ultimilor 20 de ani.

           Sunt definite ca nişte culturi individuale sau mixte de microorganisme vii sau nepatogene, susceptibile să influenţeze favorabil sănătatea fiinţei umane sau animalului care le ingerează. La om probioticele îşi manifestă efectele în cavitatea bucală sau în tubul digestiv (sub formă de alimente sau capsule), în căile respiratorii (ca aerosoli) sau în cele genito – urinare (prin aplicaţii locale).[1]

           Pentru utilizarea de către om, probioticele trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

1.      să fie de origine umană;

2.      să reziste procedeelor de fabricaţie a produselor, acidităţii gastrice, secreţiei biliare şi pancreatice;

3.      să se fixeze pe celulele epiteliale ale intestinului pentru a rezista peristaltismului şi să colonizeze, cel puţin temporar, intestinul;

4.      să producă substanţe antimicrobiene eficace faţă de bacteriile cariogene şi patogene.

În  plus  ele  trebuie  să  fi  fost  supuse  unor  teste  clinice recunoscute care au dovedit propietăţile lor favorabile pentru sănătate.

           Flora intestinală a omului, relativ simplă la sugari unde predomină suşa Bifidobacterium infantis, este foarte complexă la adult având circa 10¹⁴ (100 de mld.)  germeni, compuşi din 400 până la 500 de specii, în majoritate anaerobe. O serie de funcţii sunt atribuite microflorei intestinale:

1. obstacol la dezvoltarea şi translocarea bacteriilor patogene prin blocarea celulelor epiteliale de fixare a lor şi prin producţia de metaboliţi cu activitate antibiotică;
2. stimularea sistemului imunitar;
3. sinteza de vitamine B₁, B₂, B₁₂, K, folaţi;
4. producţia de acizi graşi inferiori, printre care acidul butiric cu funcţii biologice în intestin;
5. reacţii de hidroliză, oxidoreducere, dezacidifiere;
6. producţia de gaze (CO₂, H₂, CH₄, NH₃, SH₂);
7. împiedicarea formării de compuşi toxici, mutageni şi cancerigeni (reducerea nitraţilor la nitriţi şi nitrozamine).

Pentru  a  elimina  efectele  nefaste  ale  microflorei  şi  a  favoriza  pe cele pozitive s-a propus modificarea compoziţiei şi activităţii catalitice a florei microbiene intestinale prin diverse măsuri. Una dintre acestea constă într-un aport de probiotice pe cale alimentară; tranzitând în stare vie de-a lungul tubului digestiv ele îl colonizează temporar şi accentuează funcţiile de protecţie. Ca urmare probioticele trebuie ingerate periodic, de preferat zilnic.

7.1. Impactul antibioterapiei asupra florei intestinale

           Printre efectele secundare ale antibioterapiei, cele mai frecvente sunt accidentele digestive, de tipul diareelor de intensităţi şi gravităţi variabile, de cele mai multe ori benigne. Cele mai severe forme sunt mai frecvente la pacienţii spitalizaţi şi sunt cunoscute sub denumirea de colite pseudomembranoase, asociate cu bacteria patogenă Clostridium difficile. Se pot întâlni de asemenea şi la pacienţii ambulatorii [2].

           Diareele cauzate de antibiotice se înscriu într-o abordare de perspectivă mai largă, în sensul că efectele directe sau indirecte ale antibioticelor asupra omului şi mediului său înconjurător determină studierea aşa numitului impact ecologic al antibioterapiei. Presiunea selectivă a antibioticelor se exercită asupra microflorei digestive care din punct de vedere fiziologic formează un ecosistem bazat pe un echilibru armonios al florei intestinale şi pe interacţiunile mucoasei digestive cu această floră. Acest echilibru rezultă din mecanisme complexe, în care flora exercită o acţiune fiziologică marcantă şi care constă în sinteza de vitamine, degradarea glucidelor, lipidelor şi proteinelor alimentare, influenţa asupra măririi vilozităţilor intestinale şi în tranzitul intestinal. Pe de altă parte câţiva factori locali, printre care, mecanismele imunologice (secreţia IgA), peristaltismul intestinal, tipul de alimentaţie şi alţii influenţează şi controlează acest echilibru microbian. În acest sistem interactiv, flora bacteriană normală (formată din 10¹⁴ bacterii) exercită un „efect de barieră” sau (rezistenţă la colonizare), care se opune implantării de bacterii necomensale şi în care flora strict anaerobă, care este cea mai numeroasă şi dominantă, joacă un rol major [3].

           Practic toate grupele de antibiotice (cu excepţia vancomicinei şi aminozidelor) sunt susceptibile de a provoca diaree frecvent variabilă, cu toate că speciile anaerobe din flora dominantă fac parte din spectrul lor de acţiune şi concentraţiile lor intestinale sunt ridicate.

           Manifestările diareice sunt în mod particular frecvente şi grave la pacienţii din serviciile de reanimare, unde în absenţa agenţilor patogeni specifici, infecţiile intestinale survin ca anomalii profunde ale microflorei digestive cauzate de stress, de imunodepresie sau de antibioterapie adesea masivă. În acest context o patologie severă asociată cu administrare de antibiotice este colita pseudomembranoasă, în cursul căreia multiplicarea lui Clostridium difficile, este însoţită de producerea simultană a două toxine, o enterotoxină (toxina A) şi o citotoxină (toxina B), care produc leziuni la nivelul mucoasei colonului şi semne clinice severe.

           De aceea a fost propusă o terapeutică specifică, destinată a eradica eventualii agenţi patogeni şi de a corecta tulburările hidroelectrolitice şi care constă în administrare de microorganisme nepatogene pentru restabilirea unui nou echilibru ecologic intestinal. Pentru a avea o eficacitate ridicată, aceste microorganisme trebuie să fie viabile, pentru a rezista în tubul digestiv, într-un număr mare pentru a avea efect de barieră de substituţie şi să fie insensibile la principalele antibiotice utilizate în mod curent la antibioterapie[4].

           Pentru realizarea acestor obiective au fost efectuate numeroase studii asupra sensibilităţii la antibiotice a principalelor preparate probiotice disponibile, formate din microorganisme de substituţie, pentru a se realiza un procedeu de control ecologic al dezordinii digestive indusă de antibioterapie.

           Într-un studiu efectuat în Franţa în anul 1995, s-au utilizat 2 tulpini de drojdii, Saccharomyces boulardii şi Saccharomyces cerevisiae, precum şi 4 tulpini bacteriene, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bifidus, Bacillus cereus şi Lactobacillus casei varietatea rhamnosus. Antibioticele folosite „in vitro” au cuprins, monociclină, doxycilină, cefuroximă, ceftriaxon, asociaţia trimetroprim – sulfometoxazol şi norfloxacină.  S-a determinat concentraţia minimă inhibitorie (CMI) şi concentraţia minimă bactericidă (CMB) a acestor antibiotice faţă de microorganismele studiate. Concentraţiile finale ale soluţiilor de antibiotice, au fost cuprinse între 0,03 şi 128 mg/l. Pentru determinarea CMI s-a utilizat o tehnică de microdiluţie în mediu lichid cu un inocul de 10¹⁰ UFC, în prealabil etalonat. Studiul CMB s-a realizat ţinând cont de exigenţele particulare ale microorganismelor studiate, mediile de cultură utilizate fiind mediu MRS pentru Lactobacillus acidophilus şi Lactobacillus casei, mediu MRS special pentru Lactobacillus bifidus, mediu Mueller – Hinton pentru Bacillus cereus. Saccharomyces boulardii şi Saccharomyces cerevisiae au fost obţinute în suspensie în mediu YNB, completat cu 5% glucoză, plecând de la mediul Sobouraud înclinat. Cele două tulpini de drojdii nu au fost testate pentru CMB, ştiindu-se rezistenţa lor la antibioticele testate [5] .

           Determinarea CMI pentru cele 6 microorganisme studiate a dus la împărţirea acestora în 2 categorii. Cele două levuri studiate, Saccharomyces boulardii şi Saccharomyces cerevisiae au rezistenţă totală la tetraciclină (CMI = 32 mg/l pentru monociclină şi doxicilină), la peniciline (MCI > 128 mg/l pentru amoxicilină şi penicilină V), la cefalosporine (CMI > 128 mg/l pentru cefodoxil, cefaclor de prima generaţie (C₁G), cefuroxină de a doua generaţie (C₂G), cefoperazonă, ceftriaxon de a treia generaţie (C₃G)), la quinolone (CMI > 128 mg/l pentru norfloxacină) şi la trimetroprim – sulfametoxazol (CMI > 128 mg/l).

           Cele 4 bacterii studiate sunt reprezentate de 2 tulpini de Lactobacillus, o tulpină de Bacillus cereus şi o tulpină etichetată ca Bacillus bifidus care în realitate este un Bifidumbacterium bifidum şi reprezintă constituentul predominant al florei intestinale a noilor născuţi. Dintre peniciline, amoxicilina inhibă lactobacilii la concentraţii cuprinse între 0,03 şi 0,125 mg/l şi este mai puţin activă asupra lui Bacillus bifidus (CMI = 1 mg/l). Oracilina are o activitate mediocră asupra celor 4 bacterii, toate fiind inhibate la CMI = 16 mg/l. Cefalosporinele de a treia generaţie, sunt foarte active asupra lui Lactobacillus acidophilus şi Bacillus bifidus, CMI este de 0,125 mg/l pentru cefuroximă şi 4 mg/l pentru cefadroxil şi ceftriaxon. Norfloxacina este foarte activă asupra lui Bacillus cereus şi Lactobacillus casei (CMI = 0,03 – 0,125 mg/l), iar trimetroprim – sulfometoxazol este mediocru activ asupra celor 4 bacterii cu un CMI cuprins între 2 – 8 mg/l.

7.2. Cercetări experimentale cu Saccharomyces boulardii

7.2.1. Modele animale experimentale

Efectul antagonic exercitat de Saccharomyces boulardii asupra drojdiei Candida albicans a fost demonstrat pe şoarecii gnatoxenici, legat de efectul protector faţă de Candida albicans, prin administrarea simultană a 5 × 10⁹ celule de Saccharomyces boulardii. Eliminarea tulpinii Candida albicans în urma administrării de Saccharomyces boulardii este cuprinsă între 50 – 100%. Acest efect antagonist se exercită şi asupra altor specii de Candida (Candida crusei şi Candida pseudotropicalis), dar nu şi asupra drojdiei Candida tropicalis.

Într-un model de colită cauzată de Clostridium difficilela şoarecii gnotobiotici, cărora li s-a aplicat un tratament preventiv, oral, cu Saccharomyces boulardii în suspensie (10¹⁰ celule/ml), a permis reducerea semnificativă a mortalităţii cauzate de infecţia experimentală cu Clostridium difficile (10⁸ UFC/ml). În acest experiment 56% din şoareci au fost protejaţi prin administrarea continuă de Saccharomyces boulardii cu 4 zile înainte de inocularea cu Clostridium difficile în timp ce în lotul martor au fost 0% supravieţuitori [6] . La şoarecii axenici, de asemenea s-a studiat un protocol analog, în care loturile de animale infectate cu o suşă toxinogenă de Clostridium difficile au fost tratate cu Saccharomyces boulardii, faţă de unele loturi martor netratate. Examenul la microscopul electronic cu baleaj a arătat leziuni specifice la nivelul mucoasei intestinale, caracteristice colitei produsă de Clostridium difficile la loturile martor, şi absenţa sau puţine leziuni la animalele tratate. La acestea din urmă numărarea celulelor de Clostridium difficile nu a arătat o reducere semnificativă a numărului de bacterii, însă cantitatea de toxine A şi B a fost semnificativ redusă prin administrarea de Saccharomyces boulardii.[ [7], [8]]

La hamsteri, administrarea de Saccharomyces boulardii animalelor care au primit clindamicină a redus semnificativ mortalitatea cauzată de Clostridium difficile în proporţie de peste 50%, în raport cu lotul martor netratat cu clindamicină. Într-un alt studiu efectuat hamsterii care au primit o doză letală de clindamicină (10 mg/kg), s-a arătat că după tratamentul cu vancomicină, animalele supravieţuiesc, dar sigur s-a putut observa dezvoltarea de > 10⁶ UFC de Clostridium difficile. Într-un lot tratat, la sfârşitul a 10 zile de vancomicină, cu o suspensie de 5× 10⁸ UFC/ml de Saccharomyces boulardii, s-a constatat o diminuare semnificativă a numărului de colonii de Clostridium difficile, o scădere a nivelului de toxină B şi o valoare negativă a testului latex (LAT) pentru această toxină (3% din animale sunt pozitive la acest test dintr-un lot de animale tratate cu Saccharomyces boulardii, faţă de 33% din animale din lotul martor).

7.2.2. Studii cu Saccharomyces boufardii în terapia umană

           Într-un studiu controlat faţă de placebo, raportul dintre numărul de zile cu diaree şi numărul de zile de observaţie (22,7 zile) a fost de 1,5% la pacienţii care au fost trataţi cu titlu preventiv prin administrarea de Saccharomyces boulardii, faţă de 9,1% din lotul martor. Foarte recent în colitele pseudomembranoase asociate cu Clostridium dificile, administrarea de Saccharomyces boulardii, într-o terapeutică standard bazată pe vancomicină, a redus semnificativ procentul de recidive, cu un răspuns favorabil la 85% dintre pacienţi şi a eradicat bacteria şi toxinele sale. [9]

           În studiile efectuate pe pacienţi spitalizaţi, s-a arătat că incidentele cu diaree sunt de 22% la grupa placebo, faţă de 9,5% la grupa de pacienţi trataţi cu Saccharomyces boulardii.

7.2.3. Persistenţa celulelor de Saccharomyces boulardii în tubul digestiv

           Această persistenţă, cu sau fără prezenţă simultană a antibioticelor în lumenul intestinal, într-o anumită perioadă considerată de risc, trebuie pusă în evidenţă. Un studiu recent demonstrează la şobolani, persistenţa celulelor viabile de Saccharomyces boulardii în prezenţa antibioticelor, neomicină, ampicilină şi clindamicină, administrate înainte de absorbţia unei doze unice de Saccharomyces boulardii (4×10⁹ UFC/kg). S-a determinat nivelul de celule de drojdie după 72 şi 96 ore de la administrare, găsindu-se că acesta este de 2 până la 7 ori mai ridicat, în prezenţa antibioticelor. Aceste rezultate demonstrează însensibilitatea drojdiei Saccharomyces boulardii la aceste antibiotice, ceea ce constituie o caracteristică indispensabilă a eficacităţii preparatelor comerciale de pe piaţă, Ultra – Levure, enterol. Persistenţa drojdiei Saccharomyces boulardii şi farmacocinetica sa intestinală a fost în mod egal studiată pe şobolani şi pe voluntari, obţinându-se rezultate comparabile [10] .

7.2.4. Translocaţia microbiană

           Un alt efect al perturbărilor microbiene legat de antibiotice este fenomenul de translocaţie microbiană, care constă în complicaţii infecţioase la distanţă de sfera digestivă, cum sunt pneumopatiile [41]. Implantarea digestivă de titruri ridicate de bacterii multirezistente, ca agenţi infecţioşi nosocomiali (Pseudomona aeruginosa, Enterobacter cloacae, Klebsiella sp.) la pacienţii din reanimare şi producerea de către aceşti agenţi a β - lactamazei cu spectru larg, poate duce la trecerea acestor bacterii din tractul intestinal, prin ganglionii mezenterici, la alte organe, producând infecţii extradigestive. Translocaţia este mai frecventă în traumatismele intestinale, iradiere, stări de şoc, chimioterapie sau sub acţiunea altor factori susceptibili de a modifica permeabilitatea epiteliului intestinal. Nivelul inoculului bacterian este de asemenea un factor favorizant (> 10¹² UFC). Prevenirea translocaţiei se bazează pe decontaminarea selectivă a tubului digestiv (SDD), utilizând doze forte de antibiotice asociate, administrate oral şi cu absorbţie încetinită, la nivelul căilor digestive, ca polimixine, colistin sau acid nalidixic, asociate cu aminozide şi amfotericină B, iar câteodată şi vancomicină. Acest procedeu este uneori controversat, fiind adesea utilizat pentru reducerea semnificativă a mortalităţii pacienţilor din reanimare.

           Translocaţia drojdiei Candida albicans poate de asemenea să producă şi să determine o candidoză sistemică la pacienţii imunodeprimaţi [11] . În experimentele pe şoareci liberi de patogeni specifici (SPF), după decontaminarea digestivă timp de 4 zile cu streptomicină şi penicilina G şi ingestia de Candida albicans (10⁹ celule/ml) şi de Saccharomyces cerevisiae (5×10⁸ UFC/ml) s-a redus semnificativ, incidentele de translocaţie, dar nu şi numărul de celule de Candida albicans. Din contră, la şoarecii imunosupresivi, care au primit prednisolan, s-a întâlnit un număr semnificativ mărit de translocaţii. În prezenţa drojdiei Saccharomyces boulardii au fost semnificativ reduse, incidenţa translocaţiilor, numărul de celule de Candida albicans în alte organe şi siturile infecţioase secundare după translocaţie. Aceste rezultate sugerează un potenţial avantaj pentru utilizarea drojdiei Saccharomyces boulardii la pacienţii cu risc, însă aceste studii trebuie continuate.

7.2.5. Infecţia cu Clostridium difficile la copii

           La copii infecţia cu Clostridium difficile se exprimă în mod excepţional printr-o colită pseudomembranoasă şi răspunde favorabil la administrarea de Saccharomyces boulardii. În mod paradoxal s-a constatat că, colitele pseudomembranoase asociate cu Clostridium difficile sunt foarte rare înaintea vârstei de 2 ani, atunci când 60% din nou născuţi excretă asimptomatic Clostridium difficile în scaune. Acest fenomen se explică prin imaturitatea sau absenţa receptorilor specifici toxinei A, sau prin efectul de neutralizare, de către anticorpii materni. Toate formele fulminante şi mortale de colite pseudomembranoase care au fost descrise la noii născuţi, sunt raportate la virulenţa acestui germen şi nu trebuie neglijate. În mod sigur suşele toxicogenice de Clostridium difficile, care sunt responsabile la copii de enteropatiile cronice persistente, răspund la un tratament bine adaptat [12] .

           Într-un studiu, în care 19 noi născuţi şi copii, prezentau un tablou de diaree cronică cu colită, hipermeteorism şi absorbţie dificilă, a fost identificat Clostridium difficile, ca singurul enteropatogen din coprocultură. Cei mai mulţi dintre copii au primit unul sau mai multe tratamente cu antibiotice în săptămânile sau lunile precedente admisiei de Ultra – Levure.

           Tratamentul cu Ultra – Levure a condus la dispariţia simptomatologiei clinice la 18 copii şi la dispariţia toxinei B, la 16 dintre aceştia[13] .

           La ora actuală este uşor de identificat Clostridium difficile în practica curentă. Evoluţia tehnicilor de diagnostic este considerabilă în ultimii 10 ani, graţie aportului imunologiei şi geneticii moleculare. Punerea în evidenţă a efectului citopatogenic a toxinei B, din culturi celulare a fost realizată cu o tehnică de referinţă. Testele imunoenzimatice Elisa permit la ora actuală realizarea în mai puţin de 3 ore a unui diagnostic sensibil şi specific infecţiei cu Clostridium difficile. Markerii pot fi fenotipici, la fel ca rezistenţa la antibiotice, profilul electroforetic, tipurile serologice sau testele imunologice.

           Markerii genetici pot fi la fel ca profilul plasmidic, care permite identificarea specifică şi sigură a diferitelor tipuri de suşe de Clostridium difficile.

7.2.6. Mecanismul de acţiune al drojdiei Saccharomyces boulardii

           Saccharomyces boulardii eliberează „in vivo” o protează de 54 kDa, susceptibilă de a hidroliza prima dată toxina A şi receptorul său eritrocitar, sau printr-o inhibiţie,  efectele enterotoxice, ca hipersecreţia şi permeabilitatea membranară. Alte mecanisme de acţiune se referă la efectul protector al drojdiei Saccharomyces boulardii, care constă într-o creştere marcantă a concentraţiei de Iga, secretată în lichidul intestinal. La om Saccharomyces boulardii antrenează o utilizare semnificativă a dizaharidelor intestinale: sucraza, maltaza şi lactaza. Aceste efecte trofice pot fi legate de poliamine (spermină, spermidină) eliberate în cursul tranzitului intestinal de către Saccharomyces boulardii [ [14], [15] ].

7.3. Proteine terapeutice

           De la prima comercializare a unei proteine terapeutice umane din drojdie, care a fost în 1986, vaccinul contra Hepatitei B, alte câteva produse au fost cercetate şi utilizate clinic ca leukine GM – CSF, pentru transplantul de măduvă, insulina umană pentru tratamentul diabetului, factorul de necroză tumorală, iar altele sunt în diferite stadii de cercetare şi testare clinică cum ar fi vaccinul terapeutic anti HIV. În Tabelul 1 sunt listate câteva gene heterologe care au fost exprimate cu succes în celulele de drojdii şi care prezintă un real potenţial în aplicaţiile farmacologice [[16] ,[17] ].

Tabel 1. Exemple de proteine terapeutice clonate şi sintetizate de drojdii

7.4. Aplicaţii biomedicale

           Pentru descoperirea de noi agenţi terapeutici umani, celulele de drojdie au fost utilizate ca modele experimentale în cercetările biomedicale referitoare la oncologie, farmacologie, toxicologie, virologie şi genetică umană. Pentru studiile fundamentale din aceste domenii au fost utilizate două tulpini de drojdii: Saccharomyces cerevisiae şi Schizosaccharomyces pombe (Tabelul 2) [18] .

Tabelul 2. Cercetări biomedicale cu drojdii.

           Studierea proteinelor ABC din drojdie (caseta de legătură – ATP) a creat perspective de a se pătrunde în biologia moleculară fundamentală a câtorva afecţiuni umane, care sunt definite ca funcţii de transport ale unui ABC deficient şi includ fibroza chistică, adrenoleukodistrofia, sindromul Zellweger, hiperinsulinemia infantilă, sindromul Dubin – Jonson, sindromul limfocitar Tip1, diabetul insulino – dependent şi scleroza multiplă. În termenii practici cunoaşterea structurii genomului de drojdie şi homologia cu genomul uman poate duce la noi descoperiri (medicamente specifice sau terapie genică) în tratamentul acestor afecţiuni umane.

7.5. Drojdiile ca medicament aliment

Conştientizarea legăturii strânse existente între hrană şi alimentaţie a determinat recunoaşterea rolului activ pe care alimentaţia trebuie să-l joace în terapia modernă, trecându-se de la alimentele dietetice (cu rol pasiv) la alimentele medicament. Asemenea produse sunt numite şi alimente de protecţie, deoarece ele se adreseaza şi colectivităţilor expuse la anumiţi factori de risc, ca urmare a condiţiilor specifice de muncă si viaţă. Concentraţia ridicată de oxigen din atmosferă este potenţial toxică pentru organismele vii datorită formării radicalilor liberi, extrem de nocivi pentru moleculele cu activitate biologică.

Apărarea organismului contra acţiunii radicalilor liberi este asigurată de trei enzime cu rol antioxidant: superoxid dismutaza (SOD), glutation peroxidaza si catalaza. Principalul rol al acestor antioxidanti este cel de impiedicare a propagării reacţiilor radicalice.

Descoperirea prezenţei selenitului in situsul activ al glutation peroxidazei a permis înţelegerea rolului esenţial al seleniului în prevenirea unor maladii, aparent foarte diferite - distrofie musculară, necroza ficatului, tulburări de reproducere, cancer, deficit imunitar, cardiopatii, astm, ateroscleroza, depresie. Un deficit de seleniu, chiar neînsemnat, afectează
activitatea glutation - peroxidazei şi conduce la peroxidarea membranelor celulare şi intracelulare. Stresul datorat deficitului în seleniu, provoacă sindroame clinice specifice, ca de exemplu hemolize, necrozarea tesutului, degenerescenţe si ca urmare, creşte riscul dezvoltării maladiilor cronice [[19] , [20] , [21] , [22] , [23] ].

Datorită acţiunii antioxidante , imunomodulatoare şi de protecţie a celulei hepatice în ultimul timp utilizarea compuşilor cu seleniu a dat rezultate bune în profilaxia şi tratamentul anumitor forme de cancer (de prostata, pulmonar, ciroză etc.) [24]. Prin creşterea efectului bioproductiv şi acţiunea sa contra micotoxicozelor şi creşterea fertilităţii masculilor, compuşii cu seleniu pot contribui la îmbunătăţirea productivităţii şi sănătăţii animalelor de fermă.

În prezent, raţiile alimentare utilizate pentru creşterea păsărilor şi animalelor de fermă, în străinătate, sunt imbogăţite cu seleniu. Cele mai utilizate fome de seleniu sunt selenitul şi selenatul de sodiu, selenometionina şi "drojdia seleniata".[25]

Din punct de vedere biochimic administrarea de seleniu, sub forma anorganică, ca antioxidant, apare ca o metodă tot mai puţin recomandată, datorită conţinutului ridicat de oxigen al surselor anorganice de seleniu [[26] , [27] , [28]].

În prezent pe plan mondial sunt comercializate peste 30 de produse ce furnizează seleniul sub formă organică. În Romania se comercializează în special produse din import (ORGASEL 50), iar medicamentele ce conţin seleniu organic, sunt doar condiţionate în ţară (Selevit).

Biomasa de drojdie cu conţinut ridicat de seleniu este destinată utilizării ca aditiv în hrana păsărilor şi animalelor de fermă şi ca principiu activ pentru obţinerea unor medicamente cu acţiune antioxidantă, imunomodulatoare şi hepatoprotectoare.

7.5.1. Obţinerea biomasei de drojdie seleniată

           Pentru obţinerea biomasei de drojdie ce conţine seleniu intracelular s-au publicat date privind experimentarea cu tulpini microbiene din genurile Saccharomyces si Candida. Astfel, s-a brevetat un procedeu de obţinere a unor preparate de drojdie utilizate ca surse organice de
seleniu, crom sau germaniu, minerale a căror absenţă, în organism produc perturbări în procesele metabolice, ce conduc la creşterea incidenţei unor boli cum ar fi, diverse cancere, diabet.

           Autorii prezintă, de asemenea, metode de izolare a unor tulpini de Saccharomyces boulardii PY31, compoziţia mediilor de cultură pentru creşterea biomasei de drojdie şi metode de administrare a preparatelor obţinute ca supliment nutriţional la om - date ce constituie şi obiectul unui alt brevet al aceloraşi autori [ [29] , [30] ].

Procedeul brevetat cuprinde izolarea tulpinilor de drojdie din mostre de sol, screeningul tulpinilor izolate, cultivarea tulpinii selectate pe medii de cultura imbogaţite în factori de creştere, conservarea acesteia, precum şi obţinerea biomasei de „drojdie seleniata!” prin creşterea microorganismului în mediu cu adaos de seleniu anorganic.

Alt brevet prezintă un procedeu de obţinere a biomasei de drojdie cu un conţinut bogat de seleniu intracelular utinzând o tulpină de Candida utilis şi Saccharomyces cerevisiae. Autorii descriu o metodă de alimentare continuă cu substanţele nutritive şi compuşi cu seleniu în timpul ciclului de creştere al drojdiei. Rezultate mai bune privind conţinutul in seleniu al biomasei de drojdie s-au obţinut prin cultivarea tulpinii de S. cereviziae, în sistem cu alimentare continuă de mediu ce conţine selenit de sodiu (NazS03) în concentraţii crescânde mai mari de 128 ppm (μg/ml), la un volum de 7 1 mediu /bioreactor –capacitate 10l [[[31] ,[32]]. Au fost publicate date privind izolarea şi selecţia unor tulpini de drojdie ce au capacitatea de a asimila seleniul. Astfel, autorii au izolat patru tulpini de Saccharomyces cerevisiae din mostre de drojdie de bere , banane, grapefruit şi piersici fermentate [33] . Aceste tulpini au fost cultivate în medii ce conţin selenit de sodiu, în diferite concentratii. A fost selectată tulpina izolată din mostra de drojdie de bere, ce a asimilat 126-171 μg Se /g drojdie uscată în condiţii de cultivare anaerobe.

Capacitatea de asimilare a seleniului de către celulele de drojdie a fost cea mai bună, prin cultivarea acestora la temperatura de 30 -32 °C, inoculare 10% şi administrare de seleniu (N0₂SO₃) după 24 ore de cultivare.

Au fost efectuate studii asupra efectului seleniului şi al sulfului din mediu de cultură asupra asimilării seleniului organic de către celulele de drojdie [34]. Astfel, autorii au arătat că raportul între concentraţia seleniului şi sulfului, în mediu de cultură afectează puternic conţinutul seleniului în biomasa de drojdie. Utilizând un mediu de cultura cu un raport de concentraţie Se /S de 1,216 /7,95 autorii au obţinut biomasă, ce conţine >2000μg Se/ g drojdie uscată.

7.5.2. Prelucrarea mediului de cultură

           Procedeul de obţinere a biomasei de drojdie seleniată prezentat de unii autori arată, de
asemenea, fazele procesului de prelucrare a mediului de cultură rezultat la sfârşitul perioadei de cultivare a microorganismelor. Astfel, când fermentaţia este completă, se separă biomasa prin centrifugare (3500- 3900 rpm) timp de 10 minute apoi se inlătură supernatantul. Celulele de drojdie se spală de câteva ori cu apă distilată (in dilutie 1:10), pentru a îndeparta reziduurile metalice extracelulare neprocesate [35].

Unii autori au utilizat la spălarea celulelor de drojdie (S. boulardi sequela PY31)- o solutie de EDTA (pH 7,8), soluţie tampon fosfat de sodiu 0,01 M şi apă distilată. Celulele de drojdie rezultate după spălare (yeast cream) se usucă în vacuum, pentru reducerea umidităţii până la aproximativ 4,5%. Alţii indică o fază de pasteurizare a celulelor de drojdie rezultate după spălarea cu apă distilată la 85°C timp de 45 minute, prin care se reduce umiditatea biomasei la 16- 18 % urmată de uscarea acesteia. După obţinerea biomasei de drojdie seleniata se determină conţinutul în seleniu din celule, utilizând diferite metode de determinare [36].

Pentru obţinerea biomasei de drojdie seleniată (ce conţine seleniu), se izolează mai întâi tulpinile de drojdie din diferite mostre de sol, fructe fermentate (banane , grapefruit, piersici), drojdie de bere. După purificarea culturilor se face identificarea acestora. Dintre tulpinile de drojdie utilizate la obţinerea biomasei de drojdie seleniată fac parte: Saccharomyces cerevisiae, S.boulardi, S.bayanus, S. uvarum, Candida utilis şi altele [37] .                  

Pentru creşterea microorganismelor în mediu de cultură cu adaos de seleniu (selenit sau selenat de sodiu) se efectuează mai întâi selectarea (screeningul), coloniilor cele mai viabile. Fiecare dintre coloniile selectate se cultivă în mediu cu extract de malţ sau glucoză- agar şi se selectează apoi coloniile, cele mai robuste. Coloniile selectate se cultivă, fiecare , pe 1-2 tuburi cu mediu solid la temperatura de 30⁰C, timp de aproximativ 2 zile. Culturile obţinute se utilizează la insămânţarea mediului lichid de creştere a biomasei de drojdie. Se utilizează doua faze de creştere a biomasei în mediu lichid - prima constă în cultivarea drojdiei la 30°C timp de 8 -10 ore, urmată de însămânţarea acesteia în mediul de cultura şi incubarea (aprox. 18 ore) la 30°C. În prealabil se prepară soluţia de selenit sau selenat de sodiu in apă distilată şi se filtrează.

7.5.3. Metode de determinare a seleniului din mediul de cultura şi biomasa de drojdie seleniată

În literatura de specialitate se cunosc numeroase metode calitative de detemninare a seleniului care se bazează fie pe reacţii de precipitare fie pe reacţii de culoare.

Astfel cu AgNO₃, BaCl_2, Hg(N0₃)₂ seleniul sub forma SeO^2- formează precipitate albe, cristaline, solubile în acizi. Seleniul formează cu CuS0₄, un precipitat cristalin, verde albastrui.[38]

Tioureea reduce Se0₃^2- din mediile slab acide, la soluţii coloidale de seleniu, colorate în portocaliu. Acidul ascorbic (în medii slab acide) şi glucoza (în medii bazice) reduc compuşii cu seleniu la seleniu metalic, de culoare roşie.

4-Metilen-l,2-fenil diamina conduce la o coloraţie albastră-purpurie, stabilă în H₂S0₄ 50%. Analiza cantitativă are la bază metode gravimetrice , volumetrice, spectrofotometrice de absorbţie atomică. Seleniul poate fi determinat gravimetric după reducerea cu Fe(II) în mediu de HCl concentrat. Precipitatul obţinut se cântăreşte sau se dizolvă şi se determină seleniul prin absorbţie aomică.[39]

Metoda volumetrică se bazează pe tritrarea acizilor selenioşi cu tiosulfat de sodiu in exces, conform reactiei:

Na₂Se0₃ + 4 Na₂S₂0₃ +6 HCl —›Na2SeS₄O₆ + Na₂S₄C₆+ 6 NaCl +3 H₂O

Se formează monoselenopentationat, iar excesul de tiosulfat de sodiu se titrează iodometric. Clorhidratul de 3-3 diaminobenzidină, în mediu amoniacal şi în prezenta de acid formic, conduce la compuşi galbeni, extractibili în toluen cu maxim de absorbţie la λ=420 nm.

Determinarea seleniului din drojdiile cu seleniu, se realizează cu un spectofotometru de absorbţie atomica. Se face mai intâi o digestie a biomasei cu HN0₃, timp de 4 ore, apoi conţinutul de seleniu este determinat cu un spectofotometru de absorbţie atomică la 196 nm, utilizând o lampă de seleniu la 16mA.[40]

[41] Van Saene, H. K. F., Stoutenbeck, C. P., Crit. Care Med., 20, 691-703, (1992).