<< Pagina precedentã | Despre autori | Cuprins | Home | Pagina urmãtoare >>

 

2.6. Yarrowia lipolytica van der Walt şi von Arx

           Iniţial această drojdie a fost clasificată ca fiind Candida lipolytica (Harison). Este o specie heterotalică ce prezintă două tipuri de împerechere A şi B. Din fuziunea celulelor vegetative sau sporilor A şi B rezultă diploizi, care se reproduc vegetativ. În comparaţie cu Saccharomyces cerevisiae, celulele haploide de Yarrowia lipolytica cu tip de împerechere opus, fuzionează rar iar majoritatea zigoţilor rezultaţi avortează. Prin sporularea diploizilor se formează asce ce conţin 1 – 4 ascospori, care prezintă o capacitate scăzută de germinare (> 1%). Aceste trăsături negative pot fi remediate prin încrucişări repetate frate×soră până când 80 – 90% dintre asce conţin 4 ascospori, cu o capacitate de germinare de 90%. Această tulpină a fost reclasificată prima dată în Endomycopsis lipolytica (Wickerham, 1970), apoi în Saccharomycopsis lipolytica (Yarrow 1972) şi în final în Yarrowia lipolytica (Van der Walt şi von Arx, 1980).[1]

2.6.1. Dimorfismul la Yarrowia lipolytica

           Tulpinile de tip sălbatic de Yarrowia lipolytica prezintă colonii de forme variate, netede şi lucioase sau mate. Morfologia coloniilor este determinată de condiţiile de dezvoltare (aeraţie, surse de carbon şi azot, pH) şi de fondul genetic al tulpinii.

           Yarrowia lipolytica este un fung dimorfic natural, care are celule sub formă de drojdie, pseudohife şi hife septate [2]. Miceliul adevărat constă în hife septate de 3 – 5 μm. Celulele apicale ating adesea 100 μm, pe când articulaţiile au 50 – 70 μm lungime. Proporţia diferitelor forme de celule depinde de tulpina utilizată, probabil în concordanţă cu diferenţele morfologice observate la nivelul coloniei. Sunt cunoscute condiţiile care determină preferenţial forma celulelor de drojdie sau induce dezvoltarea miceliului. S-a observat că sursele de carbon, cum sunt uleiul de măsline, acidul oleic, oleil alcoolul, acidul linoleic şi trioleina, împreună cu sursele de azot ca soia, caseina din laptele de bovine sau extractul de carne induc puternic formarea hifelor la câteva tulpini de Yarrowia lipolytica. Dezvoltarea miceliului a fost inhibată prin deficienţa în sulfat de Mg şi clorură ferică sau adiţia de cisteină sau glutation. S-a realizat inducerea completă şi reproductibilă a miceliului de drojdie la tranziţia tulpinilor în mediu minimal care conţine N – acetilglucozamină ca singură sursă de carbon, dar acestea par a fi tulpini dependente. Unele studii au dus la detectarea unor schimbări fiziologice operate pe durata tranziţiei drojdie – hifă. Comparând compoziţia drojdiei şi a celulelor hifale, s-a arătat că pereţii hifali prezintă un conţinut ridicat în aminozaharuri şi un conţinut redus în proteină. Pe deasupra, activitatea ornitin decarboxilazică şi cantitatea de poliamină celulară, măresc dezvoltarea celulelor hifale pe mediu cu N – acetilglucosamină. Mutaţiile în genele SEC14 şi deleţia la XPR6, au efecte puternice în tranziţia drojdie/hifă. Totuşi, nu se cunoaşte dacă codificarea proteinelor de către aceste gene este implicată în reglarea acestei tranziţii. Mutanţii morfologici sunt incapabili de a forma hife  [3].

2.6.2. Utilizarea hidrocarburilor ca sursă de carbon

Este cunoscut de mult timp că Yarrowia lipolytica utilizează n – alcani şi l – alchene ca surse de carbon. Alcanii polimetilaţi şi clorinaţi sunt de asemenea asimilaţi de către această tulpină.

           Prima etapă în asimilare se presupune că este o emulsificare a suprafeţei celulare, cu un emulsificator celular de 27 kd, care se numeşte lipozan, şi este indus prin dezvoltarea celulelor pe n – alcani. Lipozanul conţine 88% carboxidrat şi 12% proteină. După pătrunderea în celulă, n – alcanii, sunt hidroxilaţi de către sistemul monooxigenază a citocromului P – 450. Citocromul P – 450 a fost detectat în câteva tulpini de Yarrowia lipolytica. Sinteza acestor enzime este indusă în timpul dezvoltării pe n – alcanii, dar nu şi pe glucoză, etanol sau acetat. Diferenţele în sensibilitatea represiei, pe glucoză, pe durata dezvoltării pe hexadecan şi decan indică prezenţa diferitelor gene reglatoare a citocromului P – 450 în Yarrowia lipolytica. L – alcanolul format la sfârşitul primei etape este apoi oxidat de către alcooloxidază care acţionează la nivelul membranei şi nu de către alcooldehidrogenaza NAD(P) – dependentă, care este de asemenea prezentă în Yarrowia lipolytica.

           Au fost izolaţi şi caracterizaţi câţiva mutanţi care nu utilizează alcani şi corespund la cinci clase fenotipice notate (alKA – alKE) şi care depind de intermediarii din calea de degradare a alcanilor. Mutaţiile în locus 16, cauzează o reducere semnificativă a căii de utilizare a n – alcanilor şi caracterizează trei subtipuri ai mutanţilor alKA, care sunt incapabili să utilizeze oricare alte tipuri de n – alcani (alKAa), nu numai unul din laturile scurte de atomi de carbon, de la C8 la C12 (alKb), ci şi unul din lanţurile lungi (C16) şi reprezintă subtipul alKac. Aceste date arată că în Yarrowia lipolytica există câteva sisteme de căi specifice de utilizare a n – alcanilor sau monooxigenaze specifice citocromului P450 [4].

           Yarrowia lipolytica asimilează de asemenea, alcooli (etanol) până la concentraţia de 3%, acetat până la 0,4% şi biosintetizează sau degradează acizi graşi. De asemenea secretă acizi organici şi lizină.

2.6.3. Medii de cultură

2.6.3.1. Medii complete

Mediu YPD – extract de drojdie – peptonă – glucoză

Extract de drojdie 10 g/l

Peptonă Bacto 20 g/l

Glucoză 20 g/l

Mediu YMG – extract de drojdie – extract de malţ – peptonă – glucoză

Extract de drojdie 3 g/l

Extract de malţ 3 g/l

Peptonă Bacto 5 g/l

Glucoză 10 g/l

2.6.3.2. Medii minimale sintetice

Mediu YNB – drojdie – azot

YNB 6,7 g/l

           Se recomandă diferite concentraţii ale surselor de carbon:

Glucoză 10 – 20 g/l

Acetat de sodiu 4 g/l (concentraţie mai mare reduce dezvoltarea)

Etanol 3% (concentraţii mai mari sunt toxice)

           N – alcanii, grăsimile şi acizii graşi nu au efecte toxice, şi uneori se pot folosi în concentraţii mari. Se pot folosi emulsificatori de genul Tween, dar nu este necesar, deoarece Yarrowia lipolytica secretă foarte eficient bioemulsificatori.

Mediu minimal cu tiamină (MMT)

           Câteva tulpini de Yarrowia lipolytica se dezvoltă încet în YNB, de aceea se recomandă mediul cu tiamină, când se pot obţine rate înalte de creştere.

NH4H2PO4 5 g/l

KH2PO4 2,5 g/l

MgSO4×7H2O 1 g/l

Tiamină×HCl 0,3 mg/l

Soluţie de microelemente 1 ml

           Soluţia de microelemente (mg la 100 ml)

Ca(NO3)2×4H2O 2000

FeCl3×6H2O 200

H3BO3 50

CuSO4×5H2O 10

MnSO4×4H2O 40

ZnSO4×7H2O 40

Na2MoO4 20

CoCl2 10

KI 10

           Adăugarea surselor de carbon este recomandată pentru YNB. pH este ajustat la 6 pentru majoritatea surselor de carbon şi la 4 pentru acetat sau acizi graşi. Uneori sunt probleme cu tulpinile care ascund multiple auxotrofii aminoacid şi în acest caz se utilizează 0,1% glutamină ca sursă de azot.

2.6.3.3. Medii de conjugare

Frecvenţe înalte de conjugare au fost obţinute cu YM lichid sau solid fără glucoză. Adaosul de 0,05% citrat de sodiu creşte uşor frecvenţa conjugării.[5]

Mediu YM – extract de drojdie – extract de malţ

Peptonă Bacto 6 g/l

Extract de drojdie 3 g/l

Extract de malţ 3 g/l

Agar Bacto 20 g/l

2.6.3.4. Medii de sporulare

Sporularea poate fi indusă de către o varietate de medii lichide sau solide. Uneori, mediul folosit pentru inducerea sporulării la frecvenţe înalte, depinde de tulpinile utilizate. Sporularea celulelor diploide poate fi indusă de un mediu (V8), disponibil comercial sau de YM. O frecvenţă înaltă a sporulării este indusă de YNB sau MMT care conţine 1,5% citrat de sodiu. Concentraţiile mici sau mari de citrat de sodiu, reduc dramatic frecvenţa sporulării. Reducerea aeraţiei sau temperaturi de peste 300C, micşorează frecvenţa sporulării.[6]

2.6.3.5. Medii speciale

Mediu lichid pentru inducţia proteazei

           Tulpinile se dezvoltă în faza exponenţială târzie sub o bună aerare la 230C pe mediu YPDm:

Peptonă proteoză 50 g/l

Extract de drojdie 10 g/l

Glucoză 1 g/l

Citrat de sodiu soluţie 0,2M pH 4 pentru proteaze acide

Na2HPO4, KH2PO4 50 mM pH 6,8 pentru proteaze alcaline

           Inducţia demarează atunci când D.O.600nm este de 2 – 3. Nivele maxime se realizează după 24 de ore, la D.O.600nm de cca 18.

           Mediu complet de lapte smântânit pentru proteaze alcaline: se dizolvă 10g de lapte smântânit Difco în 60 ml soluţie fosfat de Na 0,1M pH 6,8, se fierbe 10’ pe baie de apă şi apoi se repetă această operaţie, după ce se lasă 24 de ore la temperatura camerei.

Medii pentru inducţia lipazei: Clonele de lipaze pozitive sunt capabile să se dezvolte şi să formeze halouri clare pe mediu YNB cu tributirin (10 ml/l) ca singură sursă de carbon şi energie. Mediile lichide conţin ulei de măsline ca inductor,  care poate fi utilizat şi în producţia şi purificarea lipazei.

2.6.4. Temperatura în procesul de cultivare

Cele mai multe tulpini de Yarrowia lipolytica se dezvoltă la temperaturi sub 340C, dar sunt şi unele tulpini care sunt adaptate la temperaturi înalte. Temperatura recomandată pentru dezvoltare este cuprinsă între 25 şi 300C. Inducţia şi sporularea este mărită la 230C. Conjugarea şi sporularea au frecvenţa cea mai mare între 23 şi 280C, dar descreşte la temperaturi de peste 300C. Producţia de AEP este înaltă la 230C şi descreşte odată cu creşterea temperaturii [7].

2.6.5. Valoarea pH în mediile de cultură

Cele mai multe tulpini de Yarrowia lipolytica tolerează valori scăzute de pH, până la 3, dezvoltarea fiind redusă la pH 7 şi stopată la pH 8. Uneori, adaosul de soluţii cu pH mai mic de 7 sau valori scăzute de pH (pH 3,5 – 4) în mediu la începutul cultivării sunt recomandate pentru utilizarea sursei de carbon sub formă de acetat.

2.6.6. Rata de aerare

           Yarrowia lipolytica este obligatoriu aerobă, o presiune scăzută de oxigen reduce foarte puternic dezvoltarea. De aceea se recomandă o agitare puternică în cultivarea batch şi suplimentarea fermentaţiei cu cantităţi mari de oxigen. Pentru combaterea spumării, în special în timpul cultivării pe medii complete (YEPD), se adaugă câteva picături de ulei, care reduc formarea spumei. În cazul spumării, dezvoltarea microorganismului poate fi inhibată, deoarece celulele de Yarrowia lipolytica migrează rapid în spumă, având ca efect reducerea randamentului.

2.6.7. Aplicaţii biotehnologice

2.6.7.1. Secreţia de proteaze alcaline extracelulare (AEP)

Tulpinile de Yarrowia lipolytica dezvoltate pe medii bogate (YPD), la pH 6,8 secretă 1 – 2 g/l proteaze alcaline extracelulare. AEP sunt codificate de către gena XPR2, care a fost identificată din cel puţin 11 gene care controlează sinteza, secreţia şi/sau activitatea AEP.Această genă a fost clonată şi secvenţializată din trei tulpini diferite. AEP este o protează de 32 Kda, din familia subtilizinei, care este procesată intracelular dintr-un precursor glicozilat de 55 Kda. Procesarea include clivarea presecvenţei de 15 aminoacizi şi glicozilarea într-un punct unic de pe propeptidă (în timpul translocaţiei în reticulul endoplasmatic), hidroliza procesivă a unei linii de O, N terminal dipeptide (X – Ala sau X – Pro), de către dipeptidyl aminopeptidaza Golgi, urmată de clivarea propeptidei în joncţiunea Lys – Arg, dinaintea părţii mature. Endopeptidaza este codificată de gena XPR6, omoloagă cu KEX2, care de curând a fost clonată şi secvenţializată [8].

2.6.7.2. Secreţia de proteaze acide extracelulare

           Pe mediu YPD îmbogăţit, la pH 4, s-a detectat activitate proteazică acidă. Iniţial au fost descrise trei feluri de proteine de 28, 32 şi 36 Kda. Date recente arată că una dintre acestea este o protează acidă, iar inducerea acesteia are loc în condiţii similare cu cele utilizate pentru inducerea AEP, excepţie făcând valoarea pH mediului de cultură. Genele care codifică proteaza acidă au fost clonate şi secvenţializate şi distrugerea acestora, provoacă dispariţia proteazei acide.[9]

2.6.7.3. Secreţia de lipază şi esterază extracelulară

Tulpinile de Yarrowia lipolytica dispun de activitate lipazică care acţionează preferenţial asupra resturilor oleil din poziţiile 1 şi 3 ale trigliceridelor. Activitatea lipazică a fost intens studiată, gâsindu-se diferenţe între diferitele tipuri de tulpini.

           Lipazele extracelulare necesită acid oleic ca stabilizator/activator însă nu şi celulele bagate în lipaze. S-a solubilizat lipaza celulară în doi monomeri de 39 respectiv 44 Kda, diferiţi între ei prin pH optim. Lipaza există şi în peretele celular ca activator, care este rapid disociat prin purificare enzimatică. Mutanţii incapabili să utilizeze tributirinul ca sursă de carbon au fost izolaţi după cultivare pe mediu îmbogăţit în nistatină şi definesc trei grupe complementare. Gena care codifică secreţia proteinei homoloage cu lipaza fungică a fost recent clonată şi poate fi utilizată independent [10].

           Lipaza de Yarrowia lipolytica prezintă interes pentru sinteza monoesterilor acidului 2, 4-dimetylglutaric, transesterificarea diolilor mezo – ciclopentan sau este utilizată în industria pielăriei şi alimentară.

           Esteraza extracelulară termostabilă cu greutate moleculară mică (10.000 Da) este specifică pentru poziţia 1 a trigliceridelor şi a fost descrisă în urmă cu 10 ani [11].

2.7. Candida maltosa Komagata

           A fost descrisă prima dată de Kamagata în 1964, stârnind de atunci un considerabil interes academic şi comercial. Este cunoscută foarte bine abilitatea tulpinii Candida maltosa de a se dezvolta pe o varietate de substraturi care includ n – alcani, acizi graşi sau carbohidraţi şi care au determinat investigaţii intensive privind fiziologia, biochimia şi genetica moleculară. Cele mai recente studii asupra acestei specii de drojdie se referă la procesele celulare fundamentale privind proteinele ţintă, biosinteza membranei şi rezistenţa la medicamente.

2.7.1. Morfologia drojdiei Candida maltosa

           Drojdia imperfectă Candida maltosa se prezintă mai ales sub formă de drojdie adevărată. Celulele sunt rotunde sau aproape rotunde, până la ovale cu dimensiunile de 2,5 – 7×3 – 8 μm după dezvoltarea pe mediu îmbunătăţit (extract de malţ) şi se înmulţesc prin înmugurire multipolară. În cultivări submerse în condiţii de creştere limitate formează un pseudomiceliu (pseudohife) cu blastospori, însă fără clamidospori sau miceliu adevărat.

           Candida maltosa se caracterizează prin absenţa hifelor adevărate, a clamidosporilor, balistosporilor, clamidoconiilor şi artroconidiilor. Teleosporii şi ascosporii nu au fost observaţi în culturi mixte sau individuale. Mutantul spontan SBUG700 de Candida maltosa prezintă o morfologie pseudohifală (PHM) în condiţiile testate. Pe mediu solid cu extract de malţ, acest mutant formează colonii de culoare galben închis şi margine rugoasă, în contrast cu cele rotunde care sunt crem sau galbene cu margine întreagă şi netedă. Acest mutant s-a arătat a fi defectiv în cAMP, dependent de inactivarea catabolică a enzimelor gluconeogenezice [12].

2.7.2. Relaţiile filogenetice ale Candida maltosa cu alte drojdii

           Progresul realizat în clonarea moleculară şi secvenţializarea genelor comparabile din diferite specii de drojdii, constituie baza unei înţelegeri mai bune a relaţiilor lor naturale de înrudire. Acest lucru este important în special pentru genul Candida, care este un ansamblu heterolog unit în majoritate pe absenţa totală a stadiului sexual (teleomorf). Relaţiile evolutive la câteva specii de Candida au fost recent descrise pe baza secvenţelor subunităţilor de ARN ribozomal (srARN). Secvenţele srARN sunt de obicei utilizate pentru analizele filogenetice la drojdii şi fungi.

           Investigarea poziţiei evolutive a drojdiei nepatogene Candida maltosa, care asimilează n – alcani s-a realizat recent, după clonarea şi secvenţializarea genelor SSRR a subunităţilor ARN ribozomal 18s (Figura 3) [13]. Arborele filogenetic construit prin metoda valorilor convergente, arată că Candida maltosa formează un subgrup linear cu Candida tropicalis, Candida viswanathii, Candida albicans, Candida parapsilosis şi Candida quilliermondii, în cadrul acestui gen Saccharomyces cerevisiae, Candida kefir, Kluyveromyces lactis, Candida glabrota, Hansenula polymorpha şi Candida krusei formează un alt subgrup, la distanţă relativ mare de Candida maltosa şi de Candida lusitniae şi Yarrowia lipolytica, care au fost excluse din aceste două subgrupuri. Pe baza rezultatelor comparative ale ARN5S, Yarrowia lipolytica este cea mai divergentă între aceste specii.

Figura 3. Poziţia evolutivă a tulpinii Candida maltosa între alte specii de drojdie.

2.7.3. Fiziologia dezvoltării

Datorită aplicaţiilor sale în biotehnologie, Candida maltosa a fost intens studiată din punct de vedere al fiziologiei dezvoltării şi a compoziţiei biomasei. Din punct de vedere fiziologic au fost investigaţi următorii parametrii: temperatura şi pH dezvoltării, rata de creştere (μ) şi randamentul (conversia surselor de carbon biologic în biomasă microbiană), aspecte termodinamice (conceptul de substrat auxiliar şi compoziţia biomasei).

2.7.3.1. Temperatura şi pH

           Candida maltosa aparţine drojdiilor mezofile, având o temperatură optimă pentru dezvoltare cuprinsă între 32 – 340C, dar se dezvoltă şi la 370C şi mai slab la 40 – 410C. Odată cu creşterea temperaturii, descresc randamentul şi conţinutul în proteină, dar gradul de descreştere este dependent de tulpină. Drojdia Candida maltosa se dezvoltă în principal la pH optim între 4,2 – 4,6 [14].

           Pentru dezvoltarea optimă pe mediu minimal, Candida maltosa necesită vitamine, în special biotină. Dependenţa de biotină pentru dezvoltare este foarte mare, atunci când are loc pe hidrocarburi, faţă de carbohidraţi, în special la utilizarea n – alcanilor cu lanţuri scurte.

2.7.3.2. Rata de dezvoltare şi randamentul

În mediu cu săruri minerale, Candida maltosa este capabilă să se dezvolte în condiţii optimale, fără nici o limitare în cultivarea batch de laborator, cu rate specifice de creştere comparabile de 0,55 – 0,6 h-1 pe glucoză ca singură sursă de carbon şi energie şi respectiv 0,45 – 0,5 h-1 pe hexadecan. O relaţie similară, dar la valori inferioare ale lui μ a fost descrisă atunci când s-a utilizat un amestec de glucoză şi n – alcani. În condiţiile de scădere a conţinutului de oxigen din mediu, μ (sau parametrii corespunzători dezvoltării) scade puternic, dar creşterea limitării oxigenului este dependentă de substratul utilizat.

           În cultura continuă, tulpinile de Candida maltosa se pot cultiva pe carbohidraţi sau n – alcani la rate de diluţii D, cuprinse între 0,05 – 0,5 h-1. Ratele optime de diluţie pentru obţinerea unui randament crescut în producţia de biomasă sunt între 0,2 – 0,3 h-1. Aceste valori au fost realizate în bioreactoare industriale performante, care asigură o rată înaltă a transferului de masă şi căldură. Cel mai mare transfer de masă este obţinut în bioreactoarele cu recirculare. Au fost efectuate studii de eficienţă economică a proceselor biotehnologice de obţinere a biomasei, care sunt dependente de parametrii fiziologici (randamentul sau rata de conversie a substratului), de condiţiile de mediu (concentraţia sursei de carbon şi energie) şi de starea celulelor. Aceste studii pentru analiza şi stabilirea parametrilor fiziologici, includ măsurători calorimetrice foarte performante şi consideraţii termodinamice exprimate:

-         în condiţii normale de cultivare batch pe carbohidraţi sau alcani sau în cultivări continui (chemostat);

-         sub influenţa perturbărilor cauzate de substratul preferat sau limitarea oxigenului în reactoarele industriale cu recirculare utilizate pentru producţia de SCP, sau sub influenţa schimbărilor alternative a substratului din mediu (glucoză, sucroză sau n – alcani) şi a suplimentării cu oxigen în timpul cultivării de laborator sau în fermentatoarele industriale [[15], [16]];

-         pentru descrierea fenomenologică a conversiei microbiene a substratului, prin energia de legătură şi ecuaţiile bilanţului de materiale [17];

-         prin utilizarea concepţiei de control dinamic al proceselor, în timpul cultivării continui.

           În aceste investigaţii pentru optimizarea producţiei de biomasă cu Candida maltosa a fost inclus conceptul de utilizare a substratului mixt sau conceptul de substrat auxiliar. În acord cu acest concept combinarea substraturilor deficiente în energie (glucoză, sucroză, acetat, formiat) cu substraturile bogate în energie (n – alcani, acizi graşi, etanol), trebuie să ducă la îmbunătăţirea coeficienţilor de randament specific, la reducerea producţiei de căldură şi la creşterea ratei de dezvoltare şi a vitezei de utilizare a substratului pentru producţia de biomasă, de către microorganismele capabile să consume simultan ambele tipuri de substrat, fără efectele de inhibiţie sau represie (catabolică). Acest concept a fost verificat cu drojdia Candida maltosa la utilizarea simultană a sucrozei şi hexadecanului (utilizând un amestec de 85% W/W sucroză şi 15% W/W parafine) ca substraturi în cultivarea batch şi hexadecan şi formiat, hexadecan şi izopropanol, sau etanol şi formiat în cultură chemostat [18]. De asemenea eficienţa energetică legată de starea substratului este importantă în această cercetare, pentru optimizarea amestecurilor de substraturi. Astfel sistemele fermentative sucroză/drojdie, parafină/drojdie şi sucroză/parafină/drojdie au fost studiate utilizând populaţii sincrone, produse prin metoda culturilor fazate. Amestecul teoretic optimal de 85% W/W sucroză şi 15% W/W parafină, pentru rata optimă de creştere, coeficienţii de utilizare a carbonului şi oxigenului şi formarea căldurii specifice au fost verificaţi pe date experimentale. În alte condiţii de amestec, nu s-a observat utilizarea simultană a ambelor substraturi.

2.7.3.3. Compoziţia biomasei

           Compoziţia biomasei de Candida maltosa este variată şi depinde de condiţiile de dezvoltare utilizate. În mod natural, tulpinile conţin între 50 – 60% proteină totală (azot total × 6,25)sau 40 – 45% proteină adevărată, determinată conform metodei Lowry, raportată la biomasa uscată. Biomasa provenită din celule crescute pe n – alcani, conţine mai mult de 25 – 30% carboxidraţi totali (polizaharide 8 – 10% formate din manan cu moleculă mare, 3 – 4% manan cu moleculă mică, 11 – 15% glucan localizat în special în pereţii celulari, 1,5 – 2% glicogen şi 0,7% trehaloză), însă conţinutul în lipide este 13 – 14% şi de proteine 35 – 37% şi un conţinut scăzut în acizi nucleici. Biomasa de Candida maltosa conţine 4 – 5% lizină, 0,8 – 1,5% aminoacizi cu sulf şi un total de 23,5 – 26% aminoacizi esenţiali [19].

2.7.3.4. Medii de cultură

           Mediul (complex) complet: YPD (YEPD) – 1% extract de drojdie, 2% peptonă Bacto, 2% dextroză (glucoză).

           Mediul sintetic cu săruri minerale (minimal): YNB azot de drojdie bazat pe aminoacizi (Difco): Candida maltosa se dezvoltă bine în YNB cu adaos de sursă de carbon (1 – 2%) glucoză, glicerol, etanol sau n – alcani. YNB este adesea notat SD (0,67% YNB şi 2% dextroză (glucoză)) sau SG (0,67% yNB şi 2% galactoză).

           Alte medii cu săruri minerale: două medii cu săruri minerale au fost cel mai mult utilizate pentru investigaţii cu tulpina Candida maltosa (Tabelul 4) [20].

Tabelul 4. Conţinutul celor două medii în 1.000 ml apă bidistilată

Mediu 1
(g/l)
Mediu 2
(g/l)
(NH4)2SO4
3
12,75
KH2PO4
1
1,56
K2HPO4×3H2O
0,16
0,33
MgSO4×7H2O
0,7
0,41
Ca(NO3)2×4H2O
0,4
0,4
NaCl
0,5
0,5
KCl
0,08
FeCl3
0,001
Soluţie microelemente
0,2
0,45

           Soluţia de microelemente conţine în 1000 ml apă bidistilată următoarele substanţe: FeSO4×7H2O 10 g, ZnSO4×7H2O 80 g, MnSO4×4H2O 64 g, CuSO4×5H2O 8 g, 10 ml HCl concentrat.

           Vitamine: biotina (10 μg/l sau până la 1 μg/l) este necesară pentru dezvoltarea tulpinii Candida maltosa, în special pe n – alcani cu lanţuri scurte. Extractul de drojdie în concentraţie de 0,1% este de asemenea utilizat ca sursă complexă de vitamine şi aminoacizi.

2.7.3.5. Condiţii de cultivare

-         pH: dezvoltarea este stopată la pH aproape de 8, tolerează valori scăzute de pH, până la 2,5;

-         temperatura: până la 40 – 410C, dar nu 430C (drojdie mezofilă);

-         se cultivă în flacoane agitate la 100 – 240 rpm, utilizând un agitator rotativ (flacoane de 500 ml care conţin 100 ml mediu) sau în fermentatoare;

-         sunt necesare cantităţi suplimentare de oxigen pentru o dezvoltare bună pe substraturi de n – alcani.

2.7.3.6. Sistem fermentativ pentru studii fiziologice şi biochimice

Metoda de extruziune protonică aplicată la Candida maltosa şi la alte culturi dezvoltate pe azot, fără surse de carbon în mediu conţinând săruri de amoniu ca singură sursă de azot, arată că aceasta poate fi exactă şi de încredere pentru un parametru on – line, pentru descrierea producţiei de biomasă, consumului de azot (cu o rată de schimb NH4+/H+, de exact 1) şi a cantităţii surselor de carbon în procesele de fermentaţie. Această extruziune protonică a drojdiilor dezvoltate în cultură batch, care conduce la acidifierea mediului, necesită măsurarea consumului de alcooli pentru menţinerea valorii constante a pH, a fost utilizată pentru dezvoltarea unui sistem fermentativ pentru descrierea dezvoltării drojdiilor şi a selecţiei dezvoltare – consum de substrat (diferite surse de carbon şi surse de NH4 şi N) în cultură batch sau fed – batch şi determinarea mai exactă a valorilor acestora (substanţă uscată, densitate optică, conţinut proteic).

           Acest sistem fermentativ miniaturizat (volum de lucru de 90 ml) a fost aplicat pentru studierea variatelor fenomene de reglare fiziologică în drojdii ce caracterizează reglarea ratei de dezvoltare şi a citocromului P450, precum şi a altor enzime conţinute în Candida maltosa şi în alte drojdii (Yarrowia lipolytica, Debaryomyces formicorius, Saccharomyces cerevisiae) prin concentraţia oxigenului în mediu şi pentru testarea potenţialului de utilizare a diferitelor substraturi, ca surse de carbon pentru dezvoltarea drojdiilor [[21], [22], [23]].

           Extruziunea protonică poate fi indicată ca o metodă simplă şi de mare acurateţe în legătură directă cu un parametru din sistemul fermentativ (Figura  4).

Figura 4. Reprezentarea schematică a sistemului fermentativ utilizat în experimente cu Candida maltosa şi alte drojdii pentru testarea reglării, inhibiţiei şi utilizării substratului. E – electrod de pH, pO2 – electrod de oxigen, S – substrat.

           Volumul de lucru mic (50 – 100 ml) permite descrierea dezvoltării din cantităţi de substrat de 5 – 50 mg, în procese de fermentaţie fed – batch. Aplicaţia într-o fază de hidrocarburi practic inertă (pristan 1 – 2%), a fost utilizată pentru testarea dezvoltării drojdiilor pe substraturi (alcani cu lanţ scurt, l – alcooli, aldehide, acizi graşi) ce manifestă potenţial toxic sau efecte inhibitorii în cultura de drojdii sau pentru dezvoltarea pe substraturi de hidrocarburi solide (alcani cu lanţ lung, alcooli graşi, acizi graşi) în faza pristan.

           Biomasa de drojdie este produsă în flacoane agitate sau în fermentator, înainte de utilizarea substraturilor de n – alcani, glicerol sau glucoză. Ea poate fi utilizată direct din precultură, după diluţia cu mediu proaspăt, fără extract de drojdie sau după separarea preculturii prin centrifugare. Aproximativ 1 – 3 g de biomasă este utilizată pentru experimente cu limite scăzute de substrat, pe când în experimentele de cultivare pe termen lung, biomasa iniţială este mică [24].

          

Condiţiile de fermentaţie sunt:

-         volumul de lucru este de 90 ml la începutul experimentelor şi conţine maxim 30 g de biomasă de drojdie;

-         temperatura de 320C este menţinută cu un alt ultratermostat;

-         agitarea este de 1800 rpm realizată cu un agitator de laborator;

-         aerarea este directă la un debit de maxim 25 l/h sau contracurent cu azot, pentru reglarea pO2 din mediu, sau cu CO, pentru a realiza studii de inhibiţie pentru citocromul P450;

-         pH a fost menţinut peste valoarea 4,6 cu NaOH 0,1N pentru teste de utilizare a substraturilor în experimente de scurtă durată, sau cu NaOH 0,5N, în experimente pe termen lung.

2.7.4. Expresia heteroloagă a genelor P450 din Candida maltosa în Saccharomyces cerevisiae

           Testarea funcţiei individuale de inducere alcanică a formelor P450 în Candida maltosa şi expresia ei heteroloagă în Saccharomyces cerevisiae sub controlul promotorului GAL10, utilizând vectorul YEp51, sau în Candida maltosa, sub controlul promotorului heterolog a lui SAL10, a fost performantă [[25], [26]]. Pentru expresia autentică a formelor P450 în Saccharomyces cerevisiae a fost utilizată metoda PCR recombinat pentru schimbarea codonilor CTG din gene sau sADNc a citocromului P450s, de către tripleta TCT [27]. Tulpina transformantă de Saccharomyces cerevisiae (leu2his3) a fost cultivată în mediu minimal pentru drojdii (0,67% YNB, fără aminoacizi, 50 mg/l L – histidină şi 2% rafinoză ca sursă de carbon, la o densitate celulară de 0,7 – 1×108 celule/ml). Inducţia citocromului P450 a fost realizată prin adaosul a 2% galactoză în mediu de cultură. Expresia cantitativă a P450 a fost determinată prin spectrele de diferenţiere CO în celule întregi sau în extracte celulare. Expresia citocromului P450 este maximă după 8 – 15 ore de cultivare în prezenţa galactozei.

2.7.5. Purificarea proteinelor din Candida maltosa

           Un număr de proteine din Candida maltosa au fost bine purificate şi caracterizate. Printre acestea cel mai mare interes l-a cunoscut sistemul de enzime P450 şi FAOD implicat în oxidarea n – alcanilor.

           Purificarea simultană la scară largă a P450s, reductaza NADPH – P450, citocromului b şi FAOD, din Candida maltosa dezvoltată pe decan, s-a realizat printr-un complex de metode ca ultrafiltrare, partiţie de fază şi cromatografie. De asemenea au fost purificaţi P450Cm1 (P45052A3), P450Cm2 (P45052A4) şi NADH – 450 reductaza din Candida maltosa după expresia heteroloagă de înalt nivel a genelor lor în Saccharomyces cerevisiae [[28], [29]].

2.7.5.1. Purificarea citocromului P450 din Candida maltosa dezvoltată pe n – alcani

           Izolarea citocromului P450 s-a efectuat mai ales din celule cultivate sub o puternică limitare de oxigen, astfel creşterea puternică a conţinutului în alcani, induce P450 în biomasă de către factorul 4 – 6. Date recente arată că numai P450Cm1(P45052A3) şi Cm3 (P45052A5) au fost bine purificaţi din diferite tulpini de Candida maltosa. P450Cm1 a fost prima dată izolat şi caracterizat din Candida maltosa EH15 dezvoltată pe un amestec de n – alcani (C11 – C19) sub limitare de oxigen. Rezultate similare s-au obţinut la purificarea P450AlK1 (P45052A3) dintr-o tulpină dezvoltată pe tetradecan. Din Candida maltosa VSB779 dezvoltată pe decan sub limitare puternică de oxigen s-au izolat ambii citocromi P450Cm1 şi P450Cm3 printr-o metodă modificată bazată pe cromatografie pe octil – sefaroză [30].

2.7.6. Aplicaţii biotehnologice ale drojdiei Candida maltosa

-         Producţia de SCP pe bază de n – alcani, carbohidraţi şi a altor produse pe baza acestor procese biotehnologice cum ar fi extractul biolipidic şi a unor componenţi ai acestuia (ergosterol, ubiquinonă), acid glutamic şi ARN.[31];

-         Producţia unor intermediari hidrofobic pe calea oxidării alcanilor, ca alcooli graşi, acizi graşi şi în special acizi dicarboxilici (DCA), de interes comercial din mutanţii alK de Candida maltosa [32];

-         Utilizarea enzimelor din Candida maltosa ca biocatalizatori;

-         Producţia  de proteine enzimatice homoloage, direct din Candida maltosa pe n – alcani sau alte substraturi (P450s, NADPH – P450 reductază, citocrom b, FAOD, SOD, catalază) sau expresia heteroloagă a acestor gene în Saccharomzces cerevisiae şi aplicarea acestor enzime în reacţii de biotransformare [33].

           Inducerea FAOD de către alcani în Candida maltosa poate fi aplicată la oxidarea stereoselectivă a alcoolilor secundari pentru a se ajunge la alcanoli secundari enantiomeric puri al căror potenţial este interesant pentru fracţionarea membranelor sau pentru purificarea enzimelor obţinute din celule dezvoltate pe alcani. Recent, s-a descris un sistem eficient de biotransformare a acidului lauric în acid dodecanoic cu celule recombinante intacte de Saccharomyces cerevisiae care conţin o coexpresie a genelor NADPH – P450 reductazei şi CYP52A4 P450 din Candida maltosa [34]. A fost investigată şi producţia enzimatică de indolepiruvat, şi analogilor indolepiruvatului din triptofan şi derivaţi metil şi fluoro ai triptofanului utilizând triptofan aminotransferaza din Candida maltosa.

Utilizarea tulpinii Candida maltosa ca gazdă potenţială pentru producţia de proteine heterologe;

Producţia de acid muconic din catecol printr-un bioproces bazat pe dezvoltarea drojdiei Candida maltosa pe catecol;

Producţia enantioselectivă a D – aminoacizilor din substraturi racemice de DL – aminoacizi (de exemplu alanina);

Producţia a 3 şi 2 – isopropilmalat cu mutanţi leu2 şi leu1 de Candida maltosa;

Producţia a α - aminoadipot 5 – semialdehidă (AASA) cu mutanţi lis1 şi lis9 de Candida maltosa;

Izolarea mananului din Candida maltosa şi introducerea derivaţilor lui sulfonaţi în spaţiul intercelular la tutun şi castravete pentru mărirea nivelurilor de rezistenţă la bolile virale (virusul mozaicului tutunului) şi infecţiile bacteriene (tulpina patogenă Pseudomonas syringae var. lachrimans).

2.8. Trichosporon cutaneum Behrend

          Trichosporon cutaneuma fost stabilită ca specie tip a genului. Celulele crescute pe mediu cu glucoză, extract de drojdie şi peptonă diferenţiază miceliu adevărat şi astrospori, a căror lăţime şi lungime este extrem de variabilă. Celulele sunt globulare, ovale, elipsoidale sau pot prezenta şi alte forme bizare. Mărimea lor este de 3,5 – 7×3,5×14 μm. Înmugurirea poate fi abundentă sau absentă şi poate avea loc pe o bază îngustă sau largă şi este stimulată de agitarea culturii. După menţinerea timp de 3 zile la 250C, se formează o peliculă de culoare crem sau albă, catifelată, rugoasă sau încreţită, subţire sau groasă, rareori având tendinţa să se scufunde în mediu. În absenţa unei pelicule, uneori, se formează un inel, care poate varia de la incomplet la unul gros, rugos [35].

          După o lună de menţinere la 250C pe mediu cu glucoză, extract de drojdii, peptonă – agar, cultura este albă sau gălbuie spre crem închis. Arareori are o tentă uşor maronie. Suprafaţa este netedă, catifelată, zbârcită, rugoasă sau încreţită, umedă, lucioasă sau strălucitoare, cu o structură moale până la dură, convexă cu marginea întreagă sau neregulată. Cultivate pe mediu cu făină de porumb agarizat formează un miceliu abundent, iar artrosporii au mărime variabilă, adesea cu o citoplasmă optic densă. Artrosporii sunt în număr mare sau lipsesc. Frecvent se observă diferenţierea unui pseudomiceliu, care poate fi bine dezvoltat, cu blastosporii aranjaţi în lanţuri şi ciorchini. În unele culturi blastosporii cresc direct din hife sau din artrospori, singuri (izolaţi), în mici lanţuri sau sunt încolăciţi. Numărul lor este mic sau mare şi au o citoplasmă optic densă. În alte culturi miceliul poartă numai celule terminale sau ovale, care se pot întâlni singure sau în mici lanţuri. Aceste celule prezintă o citoplasmă optic densă şi cel puţin unele dintre ele se înmulţesc prin înmugurire. În altele izolate, miceliul şi atrosporii pot lua o formă bizară. Se pot întâlni şi blastospori. Se întâlnesc şi celule gigante, globuloase sau de forme bizare, în special pe mediu cu glucoză şi făină de cartof.

          Endosporii asexuali se formează prin clivare protoplasmică. Celulele globulare, elipsoidale sau în formă de pară, pot conţine 1 – 6 (sau mai mulţi) endospori, de mărimi variate, globulari sau elipsoidali. Endosporii se formează în culturi tinere, însămânţate pe mediu cu glucoză, extract de drojdie şi peptonă. Capacitatea de a forma endospori prin clivaj protoplasmic a fost aparent pierdută după câteva transferări. Se întâlnesc şi endospori formaţi prin înmugurire internă. Endosporii pot fi observaţi în culturi după 2 săptămâni, la 250C şi după o săptămână la 250C în culturile însămânţate în pantă.

          Specia Trichosporon cutaneum nu are capacitate fermentativă.

          Asimilează glucoza, galactoza (rareori - ), L – sorboza (sau - ), zaharoza (rareori - ), maltoza (rareori - ), elobioza (rareori - ), trehaloza (sau - ), lactoza, melibioza (sau - ), rafinoza (sau - ), melizitoza (sau - ), d – xiloza, L – arabinoza (rareori - ), DL – acidul lactic (sau - ), acidul citric (sau - ), inositolul (rareori - ). Tiamina şi biotina stimulează creşterea. Temperatura maximă de creştere este de 29…410C.

          Recent genul Trichosporon a fost reviziut pe baza unui număr de caracteristici referitoare la morfologie, ultrastructura porilor septali, sistemul coenzimei Q, conţinutul G+C al ADN şi la secvenţierea parţială a ARN ribozomal 26S (Figura 5) [[36], [37]].

 

Pentru menţinerea şi cultivarea drojdiei Trichosporon cutaneum au fost utilizate diferite medii de cultură. Mediul YEPD – conţine extract de drojdie 1%, peptonă 2%, glucoză 2%. Mediul sintetic minimal are în compoziţie 0,67% azot de drojdie pe bază de aminoacizi şi 2% glucoză, mediul minimal D este prezentat în Tabelul 5. Mediul solid se obţine prin adiţia a 2% agar şi suplimentarea cu aminoacizi a căror concentraţie finală este cuprinsă între 5 – 50 mg/ml-1 [38].

Tabelul 5.  Mediu minimal D, g×l-1.

Glucoză
10
(NH4)2SO4
2
(NH4)2HPO4
0,64
KCl
0,29
MgSO4×7H2O
0,15
CaCl2×2H2O
0,09
FeCl3×6H2O
4,8
MnSO4×1H2O
3,5
ZnSO4×7H2O
3
CuSO4×5H2O
0,78
Biotină
0,01
N – inozitol
20
Pantotenat de Ca
10
Tiamină (Vitamina B1)
2
Piridoxină (Vitamina B6)
0,5

 

Componentele mediului se dizolvă în apă de robinet, iar pH mediului se ajustează la valoarea 5 – 5,5 cu HCl 2M, înainte de sterilizare. Sărurile, microelementele, vitaminele şi glucoza se sterilizează separat.

2.8.2. Aspecte fiziologice

           Drojdiile genului Trichosporon au potenţial de a utiliza o varietate de surse de carbon. Trichosporon cutaneum, Trichosporon beigelli şi Trichosporon pullulans prezintă o dezvoltare bună pe monozaharide variate care includ pentoze şi hexoze, pe dizaharide ca celobioză, maltoză, lactoză, amidon şi pe acid pectic şi carboximetil celuloză. Alte surse de carbon includ etilamină, acid uric, propionat, D – alanină, D – metionină, galactaratul, L – tartarotul şi acidul ciclohexancarboxilic, pot servi de asemenea ca surse sigure de carbon pentru tulpini de Trichosporon. Pe deasupra Trichosporon cutaneum şi Trichosporon beigelli sunt capabile să utilizeze diferiţi compuşi aromatici ca singură sursă de carbon şi energie. Au fost efectuate intense cercetări privind biochimia şi fiziologia degradării fenolului, cresolului, salicilatului, benzoatului şi antranilatului şi aminoacizilor aromatici. Aceste propietăţi indică extraordinarul potenţial al tulpinii Trichosporon cutaneum pentru conversia eficientă în biomasă a variatelor surse de carbon. Trichosporon cutaneum are un metabolism oxidativ total, atingând un randament ridicat în biomasă de aproximativ 50 - 55% pe glucoză, când e  cultivat în condiţii de densitate ridicată. Concentraţia biomasei atinge 200 g substanţă uscată/l de mediu, fiind realizată în procese de cultivare continuă utilizând sistemul de reciclare a celulelor. Productivitatea înaltă de 22 g/l-1×h-1 s-a obţinut la o densitate celulară de 120 g/l [39].

           Drojdiile din genul Trichosporon au capacitatea de a acumula lipide şi de aceea ele fac parte din drojdiile oleaginoase. Procesul de acumulare a lipidelor în drojdiile oleaginoase se realizează prin dezvoltarea acestora în medi cu un raport mare între carbon şi azot (30:1), excesul de carbon fiind asimilat fără conversia lui în proteine sau acizi nucleici. Trichosporon pullulans poate acumula mai mult de 65%, din lipidele biomasei celulare. Ordinea şi cantitatea grupelor acil grase din lipide este oleat>palmitat>linoleat>stearat.

2.8.3. Aplicaţii biotehnologice ale drojdiilor din genul Trichosporon

           Drojdiile genului Trichospozon sunt curent utilizate într-un număr important de aplicaţii biotehnologice (Tabelul 6).

Tabelul 6. Aplicaţii ale drojdiilor din genul Trichospozon.

Tulpina
Numar de colectie
Utilizare
Trichospozon cutaneum
DNS70698
Studiu în bioreactoare
Genetica moleculara
Trichospozon cutaneum
ATCC46490
Degradarea fenolului
Biosenzor pentru fenol
Trichospozon cutaneum
ATCC58094
Degradarea compusilor aromatici
Trichospozon cutaneum
ATCC20509
Producerea de lipide din zer
Trichospozon cutaneum
ATCC62975
Biogeneza peroxizomilor
Trichospozon beigelii
CBS5790
Productia de polizaharide
Trichospozon pullulans
ATCC10677
Productia de amilaze, celulaze si xilanaza

           Datorită robusteţii sale Trichosporon cutaneum a fost utilizat de câţiva ani ca organism model în diferite sisteme de bioreactor. În timpul cultivării drojdiei Trichosporon cutaneum, nu s-au detectat produse ca etanol sau acetat 96 – 100 % din sursa de carbon utilizată fiind transformată în biomasă şi CO2 [40].

           Trichospozon cutaneum a fost utilizat şi ca senzor microbian, pentru determinarea necesităţii de oxigen biologic din apele uzate, pentru deteriorarea amperometrică a ionilor de amoniu în culturile mixte cu Bacillus subtilis şi Pseudomonas aeruginosa, şi pentru determinarea fenolului [41]. Pentru determinarea necesităţii de oxigen biologic, celulele de Trichospozon cutaneum au fost imobilizate prin amestecarea lor cu 10% alcool polivinilic şi turnate pe o placă de sticlă având formă de membrană. Electrodul de oxigen modificat a fost învelit cu o membrană celulară imobilizată şi o membrană de dializă. Acest biosenzor are o stabilitate operaţională de 48 de zile. Fenol hidroxilaza şi catecol 1, 2 – oxigenaza izolate din Trichospozon cutaneum au fost de asemenea utilizate pentru construcţia de biosenzori, pentru detectarea fenolului, respectiv catecolului [42].


[1] Schunck, W., Scheller, U., Juretzek, T., Methods. Enzym., (1996).

[2]  Van der Walt, J.,P., Von Arx, J. A., J.Microbiol.,46, 517-521, (1980).

[3] Goevora Olivera, L., Calco Mendez, C., Ruiz Herrera, J., J.Gen.Microbiol., 193, 485-493, (1993).

[4] Mauersberger, S., Bochmer, A., Schunck, W. H., Muller, H. G., Abstr.Int.Symp. on Cytochrome P-450 of Microorganism, Berlin, 63-64, (1991).

[5] Veber, H., Barth, G., CRC Crit. Rev. Biotechnol., 7, 281-337, (1988).

[6] Barth, G., Veber, H., J. Microbiol., 24, 403-405, (1985).

[7] Barnett, J. A., Payne, R. W., Yarrow, D., Yeasts, Cambridge University Press, Cambridge, (1990).

[8] Ogrydziak, D. M., Crit.Rev. Biotechnol., 13, 1-55, (1993).

[9] Wolf, K., Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York, 117-137, (1996)

[10] Hadeball, W., Agr. Biol. Chem., 41, 1745-1748, (1991).

[11] Mattey, M., Adoga, G., Enzyme Microb. Technol., 13, 525-526, (1991).

[12] Hofmann, K. H., Polnisch, E., Arch.Microbiol., 154, 514-517, (1990).

[13] Ohkuma, M., Hwang, C. W., Masuda, Y., Nishida, H., Sugiyama, J., Ohta, A., Takagi, M., Biosci.Biotech.Biochem., 57, 1793-1794, (1993).

[14] Zentgraf, B., Thermochim Acta, 187, 9-14, (1991).

[15] Zentgraf, B., Thermochim Acta, 187, 9-14, (1991).

[16] Zentgraf, B., Pure Appl. Chem, 65, 1915-1920, (1993).

[17] Babel, W., Acta Biotechnol., 6, 313-323, (1986).

[18] Muller, R. M., Babel, W., Acta Biotechnol., 8, 249-258, (1988).

[19] Gradova, N. B., Belov, A. P., Guselnikova, T. V., Acta Biotechnol., 10, 169-177, (1990).

[20] Huth, J., Blasig, R., Werner, S., Muller, H. G., J.Basic Microbiol., 30, 481-488, (1990).

[21] Huth, J., Blasig, R., Werner, S., Muller, H. G., J.Basic Microbiol., 30, 481-488, (1990).

[22] Huth, J., Werner, S., Muller, H. G., J. Basic Microbiol., 30, 489-497, (1990).

[23] Huth, J., Werner, S., Muller, H. G., J. Basic Microbiol., 30, 561-567, (1990).

[24] Huth, J., Blasig, R., Werner, S., Muller, H. G., J.Basic Microbiol., 30, 481-488, (1990).

[25] Scheller, U., Kraft, R., Schroder, K. L., Schunk, W. A., J. Biol. Chem., 269, 12779-12783, (1994).

[26] Zimmer, T., Schunck, W. H., Yeast, 11, 33-41, (1995).

[27] Zimmer, T., Schunck, W. H., Yeast, 11, 33-41, (1995).

[28] Avetisova, S. M., Davidov, E. R., 2nd Int.Symp. Cytochrome P-450 Microorganisms Plants, Tokyo, Abstr., 17, (1993).

[29] Schunck, W., Scheller, U., Juretzek, T., Methods. Enzym., (1996).

[30] Maueroberger, S., Persiyanova, T. B., Avetisova, S. M., Sokolov, Y. I., Schunck, W.,H., Muller, H. G., In Archakov AI, Bachmanova GI, INCO-TNC, Joint Stock Company, Moscow, 651-653, (1992).

[31] Senez, J. C., Perspectives in biotechnology and applied microbiology, elsevier, New York, 33-48, (1986).

[32] Cosey, J., Dobb, R., Mycock, G., J. Gen. Microbiol., 136, 1197-1202, (1990).

[33] Korgel, E., Menzel, R., Vogel, F., Schunck, W. H., Yeast, 12, (1996).

[34] Zimmer, T., Schunck, W. H., Yeast, 11, 33-41, (1995).

[35] Anghel, I., Vamanu, A., Popa, O., Popa, C., Cercel, M., Biologia şi Tehnologia drojdiilor vol. 3, Ed. Tehnică, Bucureşti, 15-55, (1993).

[36] Gueho, E, De Hoog, G. S., Swith, M.,T., J. Microbiol., 61, 285-288, (1992).

[37] Gueho, E., Amith, M. T., De Hoog, G. S., J. Microbiol., 61, 289-316, (1992).

[38] Wolf, K., Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York, 117-137, (1996)

[39] Neujahr, H. Y., Yeast: biotechnology and biocatalysis., M. Dekker, New York, 322-348, (1990).

[40] Yonsel, S., Deckwer, W. D., Bioingeering, 6, 12-23, (1990).

[41] Riedel, K., Longe, K. P., Stein, H. I., Huchm ,M., Ott, P., Scheller, F., Waste Res., 24, 883-887, (1990).

[42]Neujahr, H. I., Biotechnol. Bioeng., 22, 913-918, (1980).

<< Pagina precedentã | Despre autori | Cuprins | Home | Pagina urmãtoare >>
© Universitatea din Bucuresti 2002. All rights reserved.
No part of this text may be reproduced in any form without written permission of the University of Bucharest, except for short quotations with the indication of the website address and the web page.e University of Bucharest, except for short quotations with the indication of the website address and the web page.
Comments to:Ioan Florea Dumitru Last update: October 2002     Web design§Text editor: Monica CIUCIU