CARACTERIZAREA GENERALÃ
A ANTIGENELOR

 

GR. MIHÃESCU, CAMELIA MIHÃESCU

 

Convenţional, antigenele se definesc ca substanţe strãine, care, consecutiv introducerii în organismul uman sau animal pe o cale parenteralã (alta decât cea digestivã), declanşeazã sinteza anticorpilor cu care se combinã specific. Definiţia este incompletã din câteva motive.

1. Calea digestivã de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilitatea declanşãrii rãspunsului imun. Pentru agenţii infecţioşi care se multiplicã în tractul digestiv, administrarea oralã asigurã o bunã imunizare (de exemplu, vaccinul polio se administreazã oral, deşi calea parenteralã este mai eficientã).

2. Unele substanţe nonself sunt în mod eronat considerate ca neantigenice, deoarece, deşi in vivo stimuleazã reactivitatea imunitarã şi induc sinteza unei cantitãţi mici de anticorpi, in vitro nu produc reacţii vizibile antigen-anticorp.

3. Faţã de unele antigene, organismele nu declanşeazã rãspunsul imun, ci manifestã o stare de toleranţã.

4. Unele molecule în stare nativã nu induc un rãspuns imun, ci numai dupã cuplarea covalentã cu o moleculã purtãtor. Molecula nativã îşi pãstreazã proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizaţi. Astfel de molecule se numesc haptene.

J. F. Bach (1976) defineşte antigenele ca fiind molecule care, consecutiv introducerii în organism pe o cale adecvatã, induc un rãspuns imun materializat prin proliferarea celulelor limfoide şi sinteza moleculelor de recunoaştere (anticorpi şi receptori celulari), cu care se combinã in vivo şi in vitro.

Modelul general de structurã a unui antigen 

O moleculã antigenicã este alcãtuitã din douã componente;

-  componenta purtãtor (“carrier”), care corespunde celei mai mari pãrţi a moleculei:

- grupãrile determinante de specificitate sau epitopi, localizate pe suprafaţa componentei purtãtor şi formate din secvenţe specifice de monomeri. Epitopii, prin secvenţa proprie a monomerilor şi prin configuraţia spaţialã specificã, conferã individualitate chimicã şi specificitate antigenicã moleculei nonself. Grupãrile determinante de specificitate sunt echivalenţii moleculari şi funcţionali ai haptenei.

Grupãrile determinante de specificitate se gãsesc în numãr variabil pe suprafaţa purtãtorului şi pot fi identice atât în ceea ce priveşte compoziţia chimicã, cât şi configuraţia spaţialã (ca în cazul antigenelor polizaharidice cu epitopi repetitivi) sau sunt diferite, atât ca secvenţã a monomerilor cât şi în  privinţa configuraţiei spaţiale.

Fig. 1. Modelul general de structurã a unui antigen. Cea mai mare parte a oricãrei molecule antigenice este reprezentatã de gruparea carrier, pe care sunt localizaţi epitopii cu diferite configuraţii spaţiale, stimulatori ai reactivitãţii imunitare. Unii epitopi pot fi unici, iar alţii sunt multipli.  Uneori, epitopii stimuleazã sinteza anticorpilor cu afinitãţi diferite.

 Proprietãţile definitorii ale antigenelor 

În studiile experimentale asupra imunogenitãţii unor molecule sintetice, M. Sela (1969) a descris douã proprietãţi esenţiale ale antigenelor:

1. Imunogenitatea sau antigenitatea este proprietatea unui antigen complet, format din gruparea carrier şi epitopi, de a declanşa un rãspuns imun, humoral sau celular, ori de câte ori pãtrunde în organism pe o cale adecvatã. Proprietatea de imunogenitate este asociatã cu gruparea carrier a moleculei de antigen, grupare care într-o oarecare mãsurã influenţeazã şi specificitatea anticorpilor.

2. Specificitatea defineşte capacitatea antigenului întreg sau numai a epitopilor sãi de a se combina specific cu anticorpii sau cu receptorii celulari a cãror sintezã a fost indusã. Proprietatea de specificitate este dependentã, în primul rând de epitopi, dar este influenţatã într-o mãsurã mai mare sau mai micã şi de gruparea carrier.

Noţiunea de imunogen, uneori, este distinctã de aceea de antigen. Noţiunea de imunogen este mai restrictivã şi semnificã proprietatea unei substanţe, în stare nativã, de a stimula rãspunsul imun, fãrã sã necesite conjugarea cu o altã moleculã.

Noţiunea de antigen este mai largã, deoarece desemneazã molecule nonself care sunt imunogene în stare nativã sau devin imunogene dupã conjugarea cu o moleculã purtãtor. Antigenul poate fi uneori inacapabil, în forma sa nativã, sã stimuleze rãspunsul imun.

 

CLASIFICAREA ŞI IMUNOGENITATEA ANTIGENELOR

 

Dupã originea lor, antigenele sunt exogene şi endogene.

Antigenele exogene sunt cele mai numeroase şi pot fi împãrţite în trei categorii: 1) naturale; 2) artificiale; 3) sintetice. 

 Antigene naturale 

Antigenele naturale formeazã categoria cea mai cuprinzãtoare. Aici sunt incluse toate macromoleculele naturale din virusuri, microorganisme, fungi, plante şi animale.

Dupã dimensiuni se disting antigene moleculare (“solubile”) şi antigene corpusculare.

Antigenele moleculare (solubile) constituie gruparea cea mai numeroasã, care include toate tipurile de macromolecule: proteine, polizaharide, lipide, acizi nucleici.

Antigenele corpusculare (“insolubile”) sunt reprezentate de virusuri şi de celule (procariote şi eucariote). 

Antigenele moleculare 

Cele mai studiate antigene sunt proteinele şi polizaharidele, la care se adaugã conjugatele: glicoproteine, nucleoproteine, lipoproteine, peptidoglicani, glicolipide.

Proteinele sunt cele mai numeroase şi mai importante antigene moleculare. Diversitatea lor chimicã, generatã de variaţia secvenţei de aminoacizi este uriaşã. Practic, fiecare tip de moleculã proteicã nonself din lumea vie este un antigen pentru organismul animal şi uman, deoarece are o secvenţã unicã de aminoacizi, care determinã o structurã secundarã şi tridimensionalã proprie şi implicit, existenţa unor epitopi proprii ca secvenţã a aminoacizilor şi conformaţie spaţialã.

Imunogenitatea este o proprietate generalã a proteinelor, a celor cu rol structural (colagenul, cheratina, elastina, fibroina viermelui de mãtase, proteinele capsidei virale), a celor cu rol funcţional (miozinã, actinã, albuminã, hemoglobinã, mioglobinã, enzime, hormoni, imunoglobuline), a celor cu rol de depozit de aminoacizi(ovalbumina, cazeina, gliadina – din seminţele de grâu). Toate proteinele şi polipeptidele cu o greutate molecularã mai mare de 1000 D sunt imunogene, într-o mãsurã mai mare sau mai micã.

De cele mai multe ori, pentru antigenele proteice, nu se face distincţia dintre epitopii inductori ai rãspunsului imun şi gruparea carrier, deoarece proteinele posedã un spectru continuum de determinanţi antigenici, ce corespund unor secvenţe discrete ale suprafeţei moleculare localizate în zonele cele mai expuse contactului cu receptorii sistemului imunitar. Antigenitatea moleculelor globulare este determinatã adeseori, de configuraţia lor spaţialã, rezultatã din plierea tridimensionalã. Pentru cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina, lizozimul, ribonucleaza etc.), aproape toţi determinanţii antigenici sunt conformaţionali, adicã sunt rezultatul plierii spaţiale a moleculei, iar alţii sunt secvenţiali, adicã sunt reprezentaţi de o secvenţã particularã de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare (cheratina, colagenul, fibroina) au configuraţii mai simple decât cele globulare, catenele lor fiind aranjate sau rãsucite pe o singurã dimensiune. Determinanţii antigenici ai acestor proteine sunt secvenţiali, formaţi din 3-6 aminoacizi.

Sistemul imunitar al unui organism recunoaşte un numãr limitat de determinanţi antigenici ai unei molecule proteice. Epitopii, conformaţionali sau secvenţiali, care stimuleazã rãspunsul imun in vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc epitopi dominanţi. O parte a determinanţilor antigenici ai unei molecule native, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilenţioşi), nefiind accesibili sistemului imunitar al organismului, dar se pot exprima într-un anumit set de condiţii de imunizare (gazdã, adjuvant etc.). Aceştia sunt epitopi interni ai proteinelor globulare. Un determinant intern poate fi silenţios în molecula nativã, dar devine imunostimulator dupã clivarea enzimaticã a moleculei, in vivo sau in vitro. De aceea, M. Sela a recomandat utilizarea termenului de “grupare imunodominantã”, pentru epitopul sau epitopii care se exprimã în anumite condiţii(gazdã, adjuvant, cale de administrare) şi determinã specificitatea rãspunsului imun.

Fig.2. Epitopii dominanţi sunt localizaţi la suprafaţa moleculei globulare. Epitopii subdominanţi devin accesibili dupã clivarea moleculei în etapa prelucrãrii în macrofag, iar epitopii criptici sunt inaccesibili fenomenului de recunoaştere imunitarã.

Imunogenitatea antigenelor proteice se modificã în diferite condiţii.

Denaturarea moleculelor native sub acţiunea agenţilor chimici şi a cãldurii, modificarea configuraţiei moleculei sub acţiunea agenţilor reducãtori sau hidroliza enzimaticã, modificã imunogenitatea. Anticorpii specifici faţã de proteina nativã precipitã slab sau de loc proteina denaturatã termic sau chimic.

Formaldehida şi glutaraldehida sunt agenţi de legare încrucişatã a moleculelor proteice, constituind reţele multimoleculare stabile. Aceşti agenţi produc denaturarea proteinelor şi modificã funcţiile celor  cu activitate biologicã (toxine, enzime). Astfel, exotoxinele tratate cu formaldehidã, îşi pierd proprietãţile toxice, dar rãmân imunogene. Formaldehida şi glutaraldehida se folosesc pentru conservarea antigenelor cu greutate molecularã micã (peptide), dar sunt mai puţin utilizate pentru conservarea proprietãţilor antigenice ale moleculelor mari. Agenţii chimici de legare încrucişatã modificã imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformaţiei moleculei şi mascarea epitopilor sau prin modificarea chimicã a aminoacizilor epitopului.

Denaturarea semnificã deplierea structurii rãsucite a moleculelor proteice şi are loc prin modificarea pH, prin încãlzire, prin reducerea legãturilor S-S sub acţiunea ureii şi a beta-mercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare, proteina îşi pierde nu numai funcţia biologicã, dar îşi modificã specificitatea antigenicã. De exemplu, cele 4 punţi S-S ale RN-azei, între resturile de cistinã, sunt reduse de β-mercaptoetanol şi transformate în 8 resturi de cisteinã, cu pierderea totalã a activitãţii enzimatice. Anticorpii faţã de RN-aza pancreaticã bovinã nativã nu precipitã moleculele de RN-azã denaturatã prin reducerea legãturilor S-S. Invers, anticorpii faţã de RN-aza denaturatã, nu precipitã RN-aza nativã. Modificarea specificitãţii anticorpilor sugereazã cã reducerea legãturilor S-S determinã pierderea epitopilor conformaţionali.

Proteinele denaturate reverseazã greu la forma nativã, chiar prin restabilirea condiţiilor de mediu.

Hidroliza enzimaticã modificã configuraţia spaţialã a moleculelor proteice native şi diminuã imunogenitatea lor, cu atât mai mult cu cât fragmentele rezultate au dimensiuni mai mici. Prin clivare enzimaticã se anuleazã imunogenitatea epitopilor conformaţionali şi se relevã epitopi care în molecula nativã au statutul de epitopi criptici.

O atenţie specialã s-a acordat studiului imunogenitãţii unor proteine ale cãror proprietãţi biologic-active sunt uşor de evaluat: enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine, imunoglobuline (în calitatea lor de antigene), proteine ale capsidei sau ale învelişului viral.

Enzimele sunt antigenice, indiferent de originea lor. Reacţia moleculelor de enzimã cu anticorpii specifici a constituit o modalitate de determinare a poziţiei epitopilor. Anticorpii faţã de diferiţi epitopi ai moleculei de enzimã modificã în grade foarte diferite activitatea ei cataliticã. Dacã anticorpii sunt specifici faţã de epitopi localizaţi la nivelul situsului activ al enzimei, molecula îşi pierde activitatea faţã de substrat, deoarece legarea anticorpilor la situsul activ inhibã competitiv legarea moleculelor de substrat. Gradul de inhibiţie a activitãţii enzimatice este cu atât mai accentuat, cu cât molecula este mai mare. Efectul inhibitor al anticorpilor nu se produce dacã enzima a legat deja substratul specific. Dacã grupãrile determinante de specificitate ale moleculei de enzimã sunt situate în afara situsului catalitic, activitatea enzimei este parţial inhibatã, datoritã modificãrilor conformaţionale care survin dupã reacţia antigen-anticorp, sau rãmâne intactã. Foarte rar, complexul enzimã-anticorp are un efect catalitic superior, comparativ cu enzima nativã.

Hormonii sunt molecule slabimunogene, datoritã uniformitãţii relative a structurii lor chimice în regnul animal. Anticorpii specifici faţã de majoritatea hormonilor proteici se obţin prin asocierea lor prealabilã cu adjuvantul Freund. Imunogenitatea hormonilor este într-o relaţie directã cu gradul deosebirilor chimice existente între hormonul exogen şi hormonul produs de organismul receptor. Consecinţa este sinteza anticorpilor antihormon.

Proprietãţile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute, datoritã utilizãrii clinice a hormonului. Molecula de insulinã este alcãtuitã din douã catene polipeptidice, cu un numãr total de 51 de aminoacizi: 21 ai catenei A şi 30 ai catenei B. Cele douã catene sunt reunite prin punţi S-S. Structura moleculelor de insulinã de la diferite specii este foarte asemãnãtoare, 47 din cei 51 de aminoacizi fiind identici. Deosebirile se gãsesc în catena A pentru aminoacizii 8, 9 şi 10 (la bovine Ala, Ser, Val, la om sunt Thr, Ser, Ile, iar la ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferenţa este limitatã la aminoacidul C-terminal. Aceste mici diferenţe ale secvenţei de aminoacizi nu modificã funcţia hormonului. De aceea, insulina, indiferent de provenienţã, este la fel de eficientã pentru tratamentul diabetului uman. Micile diferenţe de secvenţã, în general, nu sunt sesizate de organismul receptor. Totuşi, dupã administrare prelungitã, organismele receptoare cu reactivitate imunitarã mai înaltã, sintetizeazã anticorpi anti-insulinã.

Polizaharidele, deşi au complexitate structuralã relativ mare, condiţionatã de multitudinea posibilitãţilor de legare a atomilor de carbon, sunt molecule slabimunogene în stare nativã, comparativ cu proteinele. Antigenitatea lor este conferitã de succesiunea unitãţilor componente, de configuraţia spaţialã a moleculei şi de greutatea molecularã. Cele cu greutãţi mai mici de 50 kD nu sunt imunogene. Polizaharidele sunt antigene cu epitopi secvenţiali repetitivi şi cel puţin uneori, în funcţie de originea polizaharidului şi de specia imunizatã, sunt imunogeni.

Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting douã tipuri de polizaharide: a) cele care au o catenã centralã pe care se inserã ramificaţiile laterale; b) polizaharide lipsite de o catenã centralã, iar ramificaţiile sunt dispuse aleatoriu, fãrã nici o simetrie. Rolul catenelor centrale în conferirea imunogenitãţii este controversat, dar ramificaţiile laterale au o importanţã deosebitã pentru determinarea specificitãţii antigenice a polizaharidelor. Din punctul de vedere al compoziţiei chimice pot fi homo- sau heteroplizaharide, iar în ceea ce priveşte sarcina, pot fi neutre sau încãrcate. Oligo- şi polizaharidele pot dobândi o structurã terţiarã (globularã). Uneori, configuraţia spaţialã a polimerului glucidic este determinantã pentru specificitatea sa antigenicã. Schimbãrile conformaţionale ale polizaharidelor se produc mai uşor decât ale proteinelor, pentru cã au bariere energetice scãzute. Pentru polizaharide, denaturarea este practic necunoscutã, ceea ce le conferã stabilitate. Dacã imunogenitatea polizaharidelor native este slabã, adeseori ele se comportã ca haptene, adicã devin antigenice dupã cuplarea cu un purtãtor proteic, rezultând lectine, cu o foarte largã distribuţie în lumea vie. In calitate de haptene, polizaharidele au proprietatea de specificitate, adicã se combinã cu anticorpii complementari faţã de complexul glicoproteic.

Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacterianã: dextranul şi polizaharidele capsulare.

Dextranii sunt polimeri ramificaţi de glucozã, resturile glucozil fiind unite mai ales prin legãturi de tip α 1-6, dar în funcţie de specia producãtoare, punctele de ramificaţie ale catenelor polimere pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4.

Dextranii sunt sintetizaţi în special de unele bacterii lactice, din zaharozã, dupã reacţia:

Dextranazã

N(zaharozã) --------------- (Glucozã)n +  (Fructozã)n

Dextranii au greutãţi moleculare foarte diferite (pânã la 10⁶ D), în funcţie de gradul de polimerizare. Nu sunt imunogeni şi de aceea se folosesc ca înlocuitori ai plasmei. Prin transfuzii repetate cu soluţii de dextran la om şi prin injectare repetatã la şoarece, s-au sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor antidextran este foarte înaltã. In serul animalelor imunizate cu dextrani s-au detectat douã tipuri de anticorpi: unii specifici faţã de resturile de glucozil legate 1-2 şi alţii specifici faţã de resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reacţii încrucişate, deşi deosebirea dintre cele douã categorii de molecule de dextran constã numai în modul diferit de legare a resturilor de glucozil între ele.

Polizaharidele capsulare se pot gãsi fie subforma moleculelor libere (“solubile”), fie subformã corpuscularã (ataşate celulelor bacteriene capsulate).

Variaţiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate de compoziţia glucidicã a catenei, de secvenţa monomerilor sau de modul de legare a lor în catenã, conferã tulpinilor bacteriene, specificitate antigenicã de tip. La Str. pneumoniae s-au identificat peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In compoziţia lor intrã hexoze, pentoze, derivaţii lor aminaţi, metilaţi etc. Specificitatea antigenicã a polizaharidelor capsulare depinde atât de compoziţia chimicã, cât şi de succesiunea monomerilor în catena polizaharidicã. Ca vaccinuri, polizaharidele induc starea de toleranţã.

În stare purificatã sunt molecule neimunogene, datoritã uniformitãţii lor structurale în lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce sinteza anticorpilor. Acizii nucleici nativi sunt conjugate nucleoproteice, în care acizii nucleici au rolul de haptenã. Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformaţionali. O fracţie din anticorpii anti-conjugat se combinã cu acizii nucleici. Anticorpii anti-acizi nucleici se combinã cu acizii nucleici în stare purã, indiferent de provenienţã. Proteinele asociate acizilor nucleici conferã o nouã specificitate antigenicã şi determinã sinteza anticorpilor care se combinã cu proteina putãtor.

Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obţin pe una din urmãtoarele cãi:

1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T₂, T₄, T₆), supuşi şocului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebeşte de ADN din celulele eucariote, prin prezenţa 5-hidroxi-metilcitozinei glicozilate, în locul citozinei. Anticorpii au specificitate faţã de bazele glicozilate, ceea ce explicã lipsa reacţiilor încrucişate cu alţi acizi nucleici.

2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale. Anticorpii sintetizaţi reacţioneazã cu ARN de origine bacterianã, vegetalã sau animalã, precum şi cu polinucleotidele sintetice(poli-A, poli-C, poli-U), dar nu reacţioneazã cu ADN nativ şi nici cu ADN denaturat.                                                

3. Imunizarea cu conjugate haptenã-proteinã, în care haptena este reprezentatã de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide, nucleotide, dinucleotide şi trinucleotide. Anticorpii sintetizaţi reacţioneazã atât cu haptena cât şi cu ADN nativ sau denaturat.

4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici şi albuminã metilatã. Cele douã molecule formeazã un complex necovalent, datoritã interacţiei dintre grupãrile negative ale acizilor nucleici şi cele pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetizaţi reacţioneazã cu complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ şi denaturat de diferite origini.

5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gãsesc în sângele pacienţilor cu lupus eritematos diseminat (LED).

Anticorpii sintetizaţi faţã de acizii nucleici cu rol de haptene în conjugatele cu proteine nu au specificitate, deoarece precipitã ADN monocatenar, ARN de diferite origini, poliribonucleotide şi acizii nucleici dublu catenari.

Lipidele sunt molecule neimunogene în stare nativã, dar se pot cupla cu proteinele şi în conjugatul format au rolul de haptene. Din punct de vedere imunologic, cele mai importante lipide sunt fosfatidele (sfingomielina şi cefalina) şi glicosfingolipidele(galactocerebrozida).

O haptenã lipidicã cu o importanţã practicã deosebitã este cardiolipina, din cordul mamiferelor. In sângele indivizilor infectaţi cu T. pallidum se gãsesc anticorpi care reacţioneazã cu cardiolipina înalt purificatã (reacţie încrucişatã), extrasã din cordul bovin.

Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al sintezei anticorpilor hemaglutinanţi şi în prezenţa complementului, hemolitici.

Studiul imunogenitãţii lipidelor a fost îngreunat de insolubilitatea lor în apã. Problema reactivitãţii anticorpilor cu antigenele lipidice a fost depãşitã parţial, prin utilizarea lipidelor auxiliare (lecitina şi colesterolul) în suspensia antigenicã. Disponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitãţii lipidelor asociate cu membranele.  

Haptene  

Haptenele(haptein, grec = a apuca) sunt substanţe chimice naturale sau de sintezã, cu moleculã micã, a cãror imunogenitate este condiţionatã de cuplarea cu o moleculã purtãtor, dar îşi pãstreazã proprietatea de specificitate, adicã reacţioneazã cu anticorpii specifici a cãror sintezã a fost indusã de haptena conjugatã cu o moleculã cu rol de purtãtor.

Denumirea de “haptenã” a fost introdusã de Landsteiner pentru a caracteriza din punct de vedere funcţional un extract alcoolic de rinichi de cal, neimunogen ca atare pentru iepure, dar capabil sã se combine cu anticorpii sintetizaţi dupã imunizarea iepurelui cu extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o moleculã purtãtor. El a propus ca în categoria haptenelor sã fie cuprinsã orice substanţã naturalã sau sinteticã, cu greutate molecularã micã sau mare, care în formã nativã nu poate sã inducã un rãspuns imun detectabil, dar dobândeşte capacitatea imunogenã, dupã cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o moleculã purtãtor cu greutate molecularã mare.  Conjugatul este imunogen nu numai în raport cu epitopii moleculei purtãtor, ci şi cu epitopul haptenei.

Din punct de vedere funcţional, haptenele s-au numit “jumãtãţi de antigene”, deoarece au numai una din cele douã proprietãţi esenţiale ale antigenelor: nu sunt imunogene, dar îşi pãstreazã proprietatea de specificitate. De aceea, termenul “antigenic” nu este sinonim cu cel de “imunogenic”. Haptena este un antigen, dar în forma sa nativã, nu este imunogenã.

În general, haptenele sunt molecule mici, deşi uneori, macromoleculele pot funcţiona ca haptene. Extractul alcoolic de rinichi de cal este o haptenã complexã. Haptenele simple sunt reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele medicamente etc.

Utilizând haptenele simple, prin reacţii de cuplare cu o moleculã purtãtor s-au obţinut antigene artificiale. Haptena din complexul molecular are rolul grupãrii determinante de specificitate. Studiul imunogenitãţii conjugatelor haptenã-moleculã purtãtor a permis determinarea mãrimii grupãrilor determinante de specificitate ale antigenelor şi indirect, determinarea situsului de combinare a anticorpilor. Pe aceiaşi cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea şi heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru studiile de cristalografie cu raze X a unui complex antigen-anticorp.

Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate molecularã micã, a cãror particularitate constã în aceea cã, dupã injectare, în organism se combinã spontan cu proteinele tisulare şi formeazã conjugate haptenã-proteinã, in vivo. Conjugatele haptenã-proteinã induc sinteza anticorpilor şi determinã procese de hipersensibilitate sau iniţiazã maladii autoimune. Astfel se comportã derivaţii dinitrofenolului substituiţi cu clor sau fluor, unii produşi de degradare a penicilinei. 

Antigenele corpusculare 

Antigenele corpusculare sunt, în esenţã, antigene moleculare asociate virusurilor şi celulelor. Proteinele capsidale şi glicoproteinele învelişului viral sau proteinele prezentate pe suprafaţa celulelor infectate cu virusuri, sunt foarte imunogene şi stimuleazã rãspunsul imun al gazdei. De aceea, imunitatea consecutivã infecţiei virale este, de obicei, de lungã duratã.

Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate în mediul extracelular), fie corpusculare (legate de celulã). Din prima categorie fac parte exotoxinele şi polizaharidele capsulare libere, iar din cea de a II-a, antigenul somatic O (endotoxina bacteriilor Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix, flagelina, pilina, acizii teichoici, mureina etc.

Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafeţei eritrocitare, cu determinism biochimic cunoscut, în sistemul A, B, 0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gãsesc şi pe suprafaţa celulelor tisulare, dar şi în secreţiile exocrine (salivã, suc gastric etc.), la circa 75% dintre indivizi, denumiţi “secretori”. Glicoproteinele din secreţii sunt hidrosolubile şi studiul lor a fost mai uşor decât al moleculelor eritrocitare.

Grupãrile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare au rol dominant în determinarea specificitãţii de grup sanguin, aşa cum au evidenţiat studiile de digestie enzimaticã controlatã. Eritrocitele tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun – antigenul H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafaţa antigenelor de grup 0 şi în cantitãţi progresiv descrescânde pe hematiile de grup A, Bşi Ab.

Specificitatea antigenicã de grup 0 este conferitã de L-fucozã. Grupul A are o genã ce codificã sinteza glicozil-transferazei, enzimã ce adaugã N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminalã a moleculei H. De aceea, specificitatea antigenicã a eritrocitelor de grup A este conferitã de trizaharidul N-acetil-galactozaminã, galactozã şi L-fucozã:  

N-acetil galactozaminã (α 1-3) Gal – R (R = restul catenei polizaharidice)

 α 1-2 

  Fuc

Indivizii de grup Bau o genã ce adaugã D-galactoza (în loc de N-acetil galactozaminã) la galactoza preterminalã a moleculei H, având un determinant antigenic format din douã resturi terminale de D-galactoza şi L-fucoza.

Fig. 3. Oligozaharidele cu rol de epitopi determinanţi ai grupelor sanguine ABO. Oligozaharidul este ancorat în membrana eritrocitului prin intermediul sfingomielinei, denumitã ceramidã. 85% din indivizii umani secretã substanţele de grup sanguin în salivã. La indivizii “secretori”, oligozaharidele sunt prezente sub forma conjugatelor cu polipeptidele codificate de genele secretoare (dupã Roitt, 1997).

Prezenţa restului de fucozã (adicã antigenul H) este esenţialã pentru expresia epitopilor A şi B. Gena H şi antigenul sãu lipsesc la fenotipul Bombay. De aceea, transferazele A şi B nu pot adãuga glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului şi antigenele de grup A şi B nu sunt exprimate.

Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificatã prin tratamentul in vitro cu glicozidaze: o α-glicozidazã (extrasã din bobul de cafea verde) poate cliva restul de Gal de pe hematiile de grup B şi le converteşte în hematii de grup 0, ce pot rãmâne funcţionale dupã transfuzia la subiecţii
de grup 0.

Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset, 1958) sunt molecule de suprafaţã ale majoritãţii ţesuturilor. Din punct de vedere biochimic, ele sunt strict specifice fiecãrui organism uman şi animal şi conferã individualitate biochimicã proprie fiecãrui organism. Se numesc şi antigene de transplantare, deoarece, dupã grefarea unui ţesut sau a unui organ, moleculele de histocompatibilitate se comportã ca antigene şi declanşeazã rãspunsul imun al organismului receptor, care determinã respingerea grefei.

Antigenele individuale de histocompatibilitate se evidenţiazã prin reacţia de respingere a grefei. În funcţie de raportul genetic dintre donor şi receptor, antigenele de histocompatibilitate aparţin urmãtoarelor categorii:

1) autoantigenele includ antigenele proprii de histocompatibilitate, care, în condiţii normale sunt tolerate de sistemul imunitar. Sub acţiunea unor factori fizici, chimici sau biologici, antigenele de histocompatibilitate se modificã devenind autoantigene, generatoare ale conflictelor autoimune;

2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune orga-nismelor identice din punct de vedere genetic, care aparţin unei linii genetic pure (inbred). Verificarea puritãţii genetice a unei populaţii de organisme se face prin transplantul de piele. Dacã grefa este acceptatã, organismele respective aparţin aceleiaşi linii inbred. Termenii “izoantigen” şi “inbred” nu au corespondenţã pentru populaţia umanã;

3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dupã injectare declanşeazã rãspunsul imun la organisme ale aceleiaşi specii, dar diferite genetic, de organismul donor. Aloantigenele sunt inegal rãspândite la indivizii unei specii şi induc rãspunsul imun la organismele care nu posedã antigenul respectiv. Aloantigenele se evidenţiazã dupã imunizarea unui organism, cu o suspensie celularã provenitã de la organisme ale aceleiaşi specii, dar aparţinând unui alotip diferit;

4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strãin) includ molecule care se gãsesc în/pe celulele tuturor indivizilor unei specii şi care se comportã ca antigene faţã de organismele altei specii. Heteroantigenele se evidenţiazã prin sinteza anticorpilor faţã de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii diferite.

Celulele unei specii diferite aduc în organismul receptor nu numai heteroantigene, ci şi aloantigene şi chiar autoantigene. De aceea injectarea unui heteroantigen este una dintre cele mai utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor.

Antigenele de organ sunt molecule specifice care conferã particularitãţile biochimice şi funcţionale ale celulelor unui organ. De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare diferã de proteinele ţesutului renal al aceluiaşi organism. 

Antigene artificiale 

La origine, antigenele artificiale sunt antigene naturale, modificate chimic prin cuplarea, cel mai adesea covalentã, cu una sau mai multe molecule mici, care le conferã o nouã individualitate antigenicã şi o nouã specificitate de combinare cu anticorpii, în raport cu molecula de origine.

Antigenele artificiale s-au obţinut, în principal, pornind de la moleculele proteice. Prin legarea moleculelor proteice cu diferite haptene s-au obţinut trei tipuri de antigene artificiale:

a) conjugate haptenã-proteinã, prin reacţia de diazotare, iodurare şi respectiv substituţie nucleofilã;

b) conjugate proteinã-proteinã, prin intermediul unor agenţi bifunc-ţionali de legare (diizocianaţii şi carbodiimidele);

c) proteine legate de suporturi insolubile, prin reacţia de diazotare sau prin intermediul carbodiimidelor.

a) Conjugatele haptenã-proteinã au fost utilizate de Landsteiner, în studiile cu privire la mecanismele rãspunsului imun. In conjugate, haptenele îndeplinesc rolul de epitopi (grupãri determinate de specificitate), iar mole-culele proteice au rolul de carrier. Rãspunsul imun nu este orientat strict faţã de epitopii haptenici, ci şi faţã de determinanţi antigenici ai grupãrii carrier.

Cuplarea haptenã-purtãtor necesitã existenţa unei grupãri reactive a haptenei, care sã se lege covalent cu grupãrile funcţionale ale purtãtorului, cu condiţia pãstrãrii integritãţii funcţionale a celor doi reactanţi. Haptenele se pot cupla cu purtãtori foarte diverşi, dar proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeazã conjugate foarte imunogene.

Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule proteice, prin reacţia de diazotare şi a obţinut azoproteine: 

Dupã cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei proteine, rezultã un antigen artificial care induce formarea a douã categorii de anticorpi cu specificitãţi diferite, dupã cum reacţioneazã cu haptena, sau cu molecula purtãtor.

Conjugatele azoproteice au permis studiul influenţei configuraţiei spaţiale a haptenei, asupra specificitãţii antigenice. Gruparea sulfonat a fost legatã în poziţia orto, meta sau para a haptenei aminobenzen. Antiserurile obţinute au specificitate faţã de fiecare izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu proteina, pãstreazã capacitatea de a precipita cu anticorpii specifici faţã de proteina nativã, în timp ce conjugatele cu izomerii orto- şi para- dau reacţie foarte slabã de precipitare. Concluzia este cã izomerii de poziţie induc modificãri sterice (conformaţionale) ale haptenei.

 

 

Conjugatele haptenã-proteinã se pot obţine prin reacţia de iodurare. Proteinele puternic iodurate îşi modificã specificitatea antigenicã. Ele induc sinteza anticorpilor care dau reacţii încrucişate de precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnificaţia este cã prin iodurare, proteinele îşi pierd specificitatea antigenicã. Toate proteinele iodurate induc sinteza anticorpilor faţã de o grupare ioduratã, în special faţã de tirozina ioduratã, indiferent de specificitatea grupãrii purtãtor.

O altã reacţie de obţinere a conjugatului haptenã-proteinã este cea de substituţie nucleofilã. Cele mai folosite haptene sunt 2,4-dinitrofenolul(DNP) şi 2,4,6-trinitrofenolul(TNP).

Mecanismul molecular al cuplãrii este urmãtorul: un atom de H din gruparea OH^- , NH₂⁺ sau S-SH a proteinei, este înlocuit de gruparea haptenicã prin eliminarea apei. Proteina pierde electroni, iar nucleul benzenic îi acceptã. Grupãrile donoare de electroni sunt OH^- , NH₂⁺, S-SH. Grupãrile DNP şi TNP sunt cuplate cu proteina purtãtor sub forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a 2,4,6-trinitrobenzen-sulfonatului de Na sau subforma derivaţilor halogenaţi.

Reacţia dintre o proteinã şi 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu ilustreazã mecanismul atacului nucleofilic, reacţie în care proteina cedeazã electroni, iar nucleul benzenic îi acceptã.

 

 

b) Conjugatele proteinã-proteinã se obţin prin intermediul agenţilor bifuncţionali de legare: diizocianaţii şi carbodiimidele. Deoarece grupãrile ciano au reactivitate diferitã, reacţia de cuplare se realizeazã în trepte. De exemplu, gruparea din poziţia 4 a toluilen-diizocianatului este mai reactivã decât gruparea ciano din poziţia 2. Aceasta permite ca una dintre proteine sã se cupleze în poziţia 4, iar ulterior, într-o nouã etapã a reacţiei, cea de a II-a proteinã se va cupla la gruparea ciano din poziţia 2:

 

 

Carbodiimidele, utilizate ca agenţi bifuncţionali pentru cuplarea proteinelor, sunt considerate anhidride simetrice ale ureii:

 

H2N – C – NH2  – HOH  O	HN = C =NH	H2N – C 4 N
Uree	Carbodiimida simetricã	Cianamida asimetricã

 

Carbodiimidele pot fi substituite simetric sau asimetric cu molecule proteice:

 R₁N = C = NR₁  sau R₁N = C = NR₂.

Agenţii bifuncţionali de cuplare permit obţinerea conjugatelor proteice (conjugate anticorpi-feritinã, insulinã-albuminã), dar se folosesc şi ca mediatori ai legãrii diferitelor molecule proteice pe suprafaţa eritrocitelor.

Marcajul cu feritinã este deosebit de important din punct de vedere practic, deoarece se foloseşte pentru evidenţierea electrono-opticã, la nivelul membranei, a diferitelor molecule proteice.

c) Conjugatele proteinã-suport insolubil se obţin prin cuplarea proteinelor cu un suport insolubil, prin reacţia de diazotare, prin intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se folosesc derivaţi celulozici: sephadex, sepharoza, agaroza etc. Legarea proteinei de suport, prin reacţia de diazotare, se face prin intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau argininei.

Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbenţi şi sunt folosiţi cu o eficienţã deosebitã pentru purificarea proteinelor dintr-un amestec, datoritã specificitãţii lor de combinare cu anticorpii corespunzãtori, fixaţi într-o coloanã de material inert. Antigenul complementar specificitãţii de legare a anticorpului fixat în coloanã, se leagã necovalent de imunosorbent, dupã care poate fi eluat cu un agent chimic.

Anticorpii pot fi imobilizaţi pe un suport insolubil, prin tratamentul cu un agent de legare încrucişatã (glutaraldehidã), dar multe din situsurile reactive pt fi denaturate sau rãmân ascunse.

Fig. 4. Principiul funcţional al imunosorbenţilor utilizaţi în cromatografia de afinitate. Coloana conţine sefarozã, pe care sunt fixate moleculele de anticorp. Amestecul de antigene este trecut prin coloanã, unde va fi reţinut numai antigenul care recunoaşte specific anticorpul fixat.

Cel mai bun suport de imobilizare este agaroza, un polizaharid obţinut prin fracţionarea agarului. Agaroza este rezistentã la acţiunea degradativã a enzimelor bacteriene şi a agenţilor chimici şi poate fi regeneratã. Este disponibilã subforma sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 μm şi conţine 2-8% agarozã în soluţie apoasã.

   In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci şi antigenele sau chiar celule intacte.

 Imunosorbenţii se folosesc în activitatea de cercetare şi în clinicã, pentru prepararea unor produse biologice şi a medicamentelor. 

Antigene sintetice 

Antigenele sintetice sunt polimeri de aminoacizi, cu secvenţã cunoscutã, obţinuţi in vitro. Proprietãţile imunogenice ale homopolimerilor (poli-Lys, poli-Glu, poli-Pro) şi ale heteropolimerilor au fost studiate de M. Sela. Studiul imunogenitãţii heteropolimerilor are avantajul cã oferã posibilitatea studiului influenţei compoziţiei chimice, a greutãţii moleculare şi a conformaţiei moleculare, uşurând studiul imunochimic al grupãrilor determinante de specificitate antigenicã.

Catenele polipeptidice sintetice pot fi lineare sau ramificate. Cele ramificate rezultã prin ataşarea polimerilor lineari, la o catenã polifuncţionalã. Ramificarea se obţine mai uşor cu aminoacizi aromatici.

Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu excepţia poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, poli-L-Lys. Copolimerii formaţi din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultaţi prin polimerizarea a trei aminoacizi diferiţi sunt totdeauna imunogeni. Cu cât compoziţia lor este mai heterogenã, imunogenitatea este mai accentuatã. Prezenţa aminoacizilor aromatici conferã o anumitã rigiditate a epitopilor şi implicit, o imunogenitate superioarã.

Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie sã fie catabolizaţi de aparatul enzimatic al celulelor care prelucreazã şi prezintã antigenul. Polipeptidele formate din D-aminoacizi sunt slab imunogene, datoritã incapacitãţii organismului de a cataboliza polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile în studiile de imunochimie, cu privire la:

-  determinarea mãrimii grupãrii determinante de specificitate şi indirect, a situsului de combinare a anticorpilor specifici;

-  rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietãţilor de imunogenitate;

-  rolul configuraţiei spaţiale a moleculei în conferirea proprietãţii de imunogenitate;

-  identificarea epitopilor secvenţiali şi conformaţionali.