DeterminanŢii antigenici

 

De cele mai multe ori, antigenele sunt macromolecule complexe sau chiar celule întregi, dar rãspunsul imun, dupã injectarea lor în organism, este orientat predominant faţã de situsuri discrete, strict limitate ale antigenului, denumite grupãri determinante de specificitate (gds), situsuri antigenice, determinanţi antigenici sau epitopi.

Epitopul este regiunea limitatã a antigenului care induce un rãspuns imun specific, se combinã cu situsul activ al moleculei de anticorp şi determinã specificitatea reacţiei antigen-anticorp.

Antigenele proteice prezintã cea mai mare diversitate de epitopi, atât în privinţa compoziţiei chimice, cât şi a configuraţiei spaţiale. Studiile de cristalografie cu raze X permit identificarea atomilor individuali ai unei molecule şi determinarea mobilitãţii lor, exprimatã în factori de temperaturã atomicã. Factorii de temperaturã ridicatã corespund regiunilor moleculare cu mobilitate înaltã (regiuni calde). In molecula proteicã, epitopii corespund zonelor moleculare cu o mobilitate înaltã a atomilor. La temperatura biologicã, aceste secvenţe necesitã cantitãţi mici de energie, pentru a trece dintr-o conformaţie în alta. Invers, regiunile moleculare cu mobilitate atomicã redusã au factori termici de valoare scãzutã (regiuni reci) şi necesitã o cantitate mai mare de energie pentru schimbarea conformaţiei. Adeseori, epitopii antigenici sunt localizaţi în regiunile calde ale moleculei.

Capacitatea unei regiuni a moleculei de antigen de a funcţiona ca epitop (adicã de a stimula rãspunsul imun) se numeşte imunopotenţã.

Mãrimea grupãrii determinante de specificitate s-a apreciat indirect prin determinarea mãrimii haptenei capabilã sã “umplã” complet situsul de combinare al anticorpului. În acest scop s-a utilizat sistemul dextran-antidextran, într-o reacţie de precipitare. Dextranul cu greutate molecularã de 50 kD este imunogen şi prin injectare repetatã la iepure, se obţine serul imun anti-dextran. Artificial se preparã oligozaharide cu dimensiuni controlabile. Reacţia de precipitare dextran-anticorpi specifici este inhibatã progresiv de oligozaharidul de glucozã şi este completã în prezenţa hexazaharidului. Oligomerul cu 6 resturi de glucozã corespunde celui mai bun ligand care se cupleazã cu anticorpii anti-dextran (ligandul este orice moleculã capabilã sã formeze un complex cu o altã moleculã). Heptazaharidul, ca şi oligozaharidele cu mai puţin de 6 resturi de glucozã inhibã mai puţin eficient reacţia de precipitare a sistemului dextran-antidextran. 

Fig. 5. Oligozaharidul format din 6-7 resturi de glucozã, blochezã cu cea mai mare eficienţã, reacţia de precipitare dintre dextran şi anticorpii specifici antidextran. Oligozaharidele mai mari sau mici nu se combinã eficient cu anticorpii şi inhibã într-o mãsurã progresiv mai micã reacţia de precipitare cu dextranul.

Cercetãri similare s-au fãcut cu homopolimeri de aminoacizi (poli-Lys, poli-Ala), legaţi de proteine purtãtor. Serul imun obţinut pe iepure, faţã de aceste conjugate, conţine predominant anticorpi specifici faţã de haptena homopolimericã. Reacţia de precipitare dintre serul specific şi conjugatul haptenã-proteinã, este inhibatã de pentamerul de alaninã, ceea ce denotã cã acesta se leagã cu cea mai mare afinitate de situsul de combinare al anticorpului. Pentamerul corespunde mãrimii epitopului antigenic al conjugatului şi reflectã, indirect, mãrimea situsului de combinare al anticorpilor specifici.

În concluzie, mãrimea unui epitop polizaharidic corespunde la 6-8 unitãţi monomerice, iar pentru antigenele proteice, epitopul are 4-6 aminoacizi.

Valenţa antigenului s-a definit convenţional prin numãrul de epitopi ai unui antigen. Numãrul de epitopi ai unei molecule antigenice variazã în raport cu mãrimea şi complexitatea sa structuralã.

Valenţa se evalueazã prin numãrul moleculelor de anticorp care reacţioneazã cu o moleculã de antigen. Pentru evaluarea numãrului de epitopi ai unui antigen, trebuie avut în vedere cã molecula de anticorp este bivalentã (leagã doi epitopi), dar şi faptul cã un antiser nu conţine anticorpi faţã de toţi epitopii unui antigen.

Studiile privind reacţia antigen-anticorp in vitro, au condus la concluzia existenţei a trei tipuri de valenţe antigenice (epitopi):

-  valenţele funcţionale conformaţionale sunt conferite de epitopii conformaţionali, situaţi la suprafaţa moleculei native de antigen şi sunt accesibili sistemelor imunitare de recunoaştere specificã a moleculei. Numãrul lor este proporţional cu greutatea molecularã a antigenului şi este dependent de complexitatea conformaţionalã a moleculei. Un situs antigenic, teoretic, s-ar gãsi la fiecare câteva mii de daltoni;

-  valenţele funcţionale interne sunt reprezentate de epitopi interni, care, în molecula nativã sunt inaccesibile sistemului imunitar. Ele devin funcţionale, in vivo, dupã degradarea parţialã a moleculei, în celulele care prelucreazã antigenul;

-  valenţe nefuncţionale, reprezentate de epitopi criptici care nu devin funcţionale dupã prelucrarea antigenului in vivo, dar se pot releva dupã clivarea enzimaticã in vitro a moleculei.

Numãrul total al epitopilor unui antigen nu se cunoaşte, dar se poate evalua cu aproximaţie, dupã degradarea parţialã a moleculei de antigen. De exemplu, albumina sericã bovinã nativã are 6 situsuri funcţionale conformaţionale. Dupã scindarea enzimaticã menajatã in vitro, rezultã 9 fragmente peptidice, fiecare dintre ele dând reacţie de precipitare cu serul anti-albuminã nativã. Pentru ca reacţia de precipitare sã aibã loc, sunt necesari cel puţin doi epitopi, ceea ce înseamnã cã molecula de albuminã sericã bovinã are cel puţin 18 epitopi, care devin funcţionali dupã scindarea enzimaticã a moleculei şi induc sinteza anticorpilor specifici.  

Efectul de carrier 

Antigenele prezintã o dualitate funcţionalã evidentã, conferitã de faptul cã specificitatea rãspunsului imun este orientatã predominant, dar nu exclusiv, faţã de grupãrile determinante de specificitate. La rândul sãu, suportul macromolecular (carrier) are proprietatea de imunogenitate, dar conferã şi un grad de specificitate a rãspunsului imun. Rezultatele experimentale cu conju-gate haptenã-proteinã (dinitrofenol-albuminã sericã) au evidenţiat cã în cazul în care suportul carrier este nonself, rãspunsul imun este mai intens. Antigenul artificial s-a obţinut prin cuplarea DNP cu albumina de şoarece. Injectarea conjugatului la şoarece induce un rãspuns imun slab, cu un titru scãzut al anticorpilor anti-DNP(anti-haptenã). Conjugatul DNP-albuminã sericã bovinã, injectat la şoarece, stimuleazã intens rãspunsul imun primar anti-haptenã, ceea ce demonstreazã cã gruparea carrier are rol modulator asupra rãspunsului imun.

Rolul grupãrii carrier în reactivitatea imunitarã a fost evidenţiat prin evaluarea titrului anticorpilor dupã stimularea secundarã. Animalele stimulate repetat cu haptena A, cuplatã cu purtãtorul B, produc un rãspuns imun secundar intens, cu anticorpi anti-haptenã şi anti-carrier. Însã, în rãspunsul imun secundar, dacã stimularea s-a fãcut cu haptena A, cuplatã cu un carrier diferit (C) titrul anticorpilor anti-haptenã nu creşte. Acest fenomen curios s-a denumit “efect de carrier”.

Un purtãtor eficient pentru stimularea rãspunsului imun trebuie sã fie imunogenic, adicã sã stimuleze rãspunsul celulelor T. Moleculele neimunogene sunt purtãtori ineficienţi ai haptenelor, pentru stimularea rãspunsului imun. Aceasta aratã cã mecanismele de recunoaştere pentru haptenã şi pentru gruparea purtãtor sunt diferite.

Imunizarea cu conjugate haptenã-carrier, a indus numai sinteza anticorpilor specifici anti-haptenã, dacã purtãtorul a fost un antigen T-dependent. Moleculele neimunogene nu au calitãţi de carrier pentru haptene.

“Efectul de carrier” denotã cã haptena şi epitopii purtãtorului sunt recunoscuţi separat, de limfocitele B şi respectiv T. Cele douã subpopulaţii de celule coopereazã pentru a induce sinteza anticorpilor cu specificitate de haptenã. 

 

Factorii care condŢioneazÃ

imunogenitatea

Antigenul este o substanţã nonself, care, la contactul cu celulele sistemului imunitar, declanşeazã sinteza anticorpilor specifici şi a receptorilor celulari cu care se combinã in vitro şi in vivo. Definiţia este nesatisfãcãtoare, pentru cã se referã la ce face antigenul, fãrã sã-l defineascã în termeni proprii. Definirea completã a antigenului este rezultatul  însumãrii unei serii de proprietãţi, fiecare dintre ele fiind o condiţie necesarã a imunogenitãţii, dar nu şi suficientã.

Condiţiile imunogenitãţii au fost deduse prin studii experimentale, utilizând antigene artificiale şi sintetice.

1. Caracterul strãin al moleculei este condiţia majorã a imunogenitãţii. O moleculã nonself este cu atât mai imunogenã, cu cât este mai diferitã de moleculele organismului receptor. In esenţã, caracterul nonself al unei molecule nu este strict dependent de raporturile taxonomice ale organismului donor cu cel receptor de antigen, ci este consecinţa deosebirilor de structurã molecularã.

Cele mai multe proteine ale unei specii sunt nonself pentru alte specii, dar uneori, proteinele omologe ale unor specii sunt lipsite reciproc de imunogenitate. De exemplu, hemoglobina de cal nu este imunogenã pentru iepure, deşi celelalte proteine de cal sunt imunogene. Caracterul nonself nu implicã în mod obligatoriu existenţa unor molecule cu totul noi, neîntâlnite la organismul receptor, ci numai modificãri minime ale moleculei, conferite de existenţa câtorva aminoacizi diferiţi în anumite poziţii ale catenei proteice. Pentru restul secvenţei, molecula nonself poate fi asemãnãtoare proteinelor proprii organismului receptor de antigen. Micile diferenţe de secvenţã a aminoacizilor, au rolul de epitopi. De regulã, proteinele apãrute timpuriu în evoluţie au un grad superior de asemãnare chimicã interspecificã şi sunt slab imunogene pentru speciile înrudite (de exemplu, albumina sericã), iar cele apãrute mai târziu (de exemplu, globulinele serice) sunt mai heterogene şi mai imunogene.

2. Mãrimea moleculei influenţeazã imunogenitatea moleculelor nonself. Pentru a fi imunogenã, o moleculã trebuie sã aibã dimensiuni care sã depãşeascã un prag limitã. Moleculele cu o bunã imunogenitate sunt mai mari de 10 kD. Cu cât o moleculã este mai mare, cu atât numãrul epitopilor sãi este mai mare. Secvenţele de aminoacizi cu rol de epitopi au şansa repetãrii de mai multe ori într-o moleculã mai mare. Proteinele mari (de exemplu, ovalbumina – 40 kD, albumina sericã - 70 kD, hemocianina – 6000 kD) sunt foarte imunogene, iar cele cu moleculã micã (insulina – 5,7 kD, histonele – 6 kd, glucagonul – 3,5 kD) sunt puţin imunogene. Glucagonul este cea mai micã moleculã naturalã faţã de care s-au obţinut anticorpi, iar cea mai micã moleculã sinteticã imunogenã este un polipeptid de 1,4 kD.

Pentru polizaharide, limitele minime pentru imunogenitate sunt mai mari. Dextranii sunt antigenici dacã au peste 50 kD, cu variaţii mari de rãspuns imun de la o specie la alta (omul şi şoarecele rãspund bine, cobaiul – foarte puţin).

Moleculele mici neimunogene sau slab imunogene pot dobândi o imunogenitate optimã, dupã adsorbţia pe particule inerte de colodiu, caolin sau de cãrbune. Acestea au rol de purtãtori şi asigurã creşterea taliei moleculare.

3. Complexitatea molecularã. Dimensiunile mari ale unei molecule nonself nu sunt totdeauna suficiente pentru a-i conferi imunogenitate. De exemplu, moleculele de polimeri sintetici (poli-acrilamida, nylonul) sunt foarte mari, fiind formate dintr-un numãr mare de monomeri repetitivi, dar nu sunt imunogene pentru cã nu au complexitatea molecularã minimã necesarã.

Moleculele naturale, în special proteinele au un grad înalt de complexitate, datoritã diversitãţii monomerilor componenţi. Fiecare tip de moleculã proteicã are o configuraţie tridimensionalã unicã, determinatã de secvenţa specificã de aminoacizi.

Proteinele globulare au cea mai mare complexitate antigenicã, derivatã din configuraţia lor terţiarã. Ele posedã epitopi exprimaţi pe suprafaţa moleculei native, accesibili fenomenului de recunoaştere de cãtre celulele sistemului imunitar şi epitopi interni, care pot stimula rãspunsul imun, dupã clivarea enzimaticã a moleculei în celulele specializate pentru prelucrarea antigenelor. De exemplu, serul imun anti- albuminã sericã bovinã precipitã cu fiecare din cele 9 fragmente peptidice rezultate prin clivajul enzimatic al moleculei native, ceea ce sugereazã cã in vivo, molecula este scindatã şi astfel se relevã epitopi interni, faţã de care se sintetizeazã anticorpi specifici.

Complexitatea unei molecule nu depinde numai de diversitatea monomerilor, ci şi de secvenţa lor şi de efectul secvenţei asupra structurii secundare, terţiare şi eventual quaternare a moleculei.

4. Starea fizicã a antigenului. Imunogenitatea unei molecule este condiţionatã de o anumitã rigiditate a epitopilor sãi. Lipsa rigiditãţii ar explica imunogenitatea redusã a gelatinei, o proteinã denaturatã, derivatã din hidroliza colagenului, foarte bogatã în glicocol (21-35%).

În mod obişnuit, rotaţia liberã a unei molecule are loc numai între C α şi legãtura peptidicã. Glicocolul nu realizeazã ramificaţii ale catenei polipeptidice în poziţia C α, ceea ce face ca molecula de gelatinã sã prezinte rotaţii libere în jurul axului longitudinal. Gelatina are o proporţie foarte micã de aminoacizi aromatici (Tir, His), iar cisteina şi triptofanul lipsesc. Legarea
L-Tir, în proporţie de 2% mãreşte gradul de imunogenitate a gelatinei. Complexul induce sinteza anticorpilor care precipitã gelatina nativã.

5. Solubilitatea. Condiţia solubilitãţii unui antigen pentru a fi imunogen este sugeratã de urmãtarele observaţii:

-  polimerii macromoleculari sintetici care nu sunt solubilizaţi, adicã nu sunt hidrolizaţi, sunt lipsiţi de imunogenitate;

-  organismele cu echipamente enzimatice hidrolitice mai active (şoarece) elaboreazã un rãspuns imun mai amplu faţã de un antigen greu solubil(de exemplu, polizaharidul de pneumococ), în raport cu organismele care hidrolizeazã mai greu (de exemplu, iepurele);

-  antigenele corpusculare (celule, virioni) devin imunogene dupã solubilizarea şi eliberarea componentelor imunogene în macrofag, unde are loc degradarea menajatã a antigenelor.

Hidroliza enzimaticã a antigenului nu este totdeauna o condiţie prealabilã obligatorie a imunogenitãţii. Studiile cu antigene sintetice au arãtat cã, în momentul recunoaşterii de cãtre celulele sistemului imunitar, o parte a epitopilor sunt intacţi, identici cu aceia ai moleculei native.

6. Accesibilitatea determinanţilor antigenici. Pentru ca un epitop sã fie imunogen, trebuie sã fie expus la suprafaţa moleculei, pentru a fi accesibil mecanismelor de recunoaştere imunitarã. De exemplu, un polimer de L-Lys, cu rol de purtãtor pentru tripeptidul Tir-Ala-Glu este imunogen. Dupã mascarea epitopilor tripeptidici cu catene de poli-Ala, molecula îşi pierde imunogenitatea.  

Fig. 6. Rolul accesibilitãţii determinanţilor antigenici în imunogenitate. Copolimerul multicatenar format din acidul L-glutamic (G) şi tirozina (T), legat prin intermediul poli L-alaninei (A-A), de purtãtorul polilizinã este imunogen. Acelaşi copolimer, legat direct de purtãtorul polilizinã, dar mascat de polialaninã, este neimunogen.

7. Configuraţia spaţialã a moleculei este un factor decisiv pentru imunogenezã. Studiile privind imunogenitatea antigenelor sintetice, au evidenţiat cã cel mai adesea, anticorpii se formeazã faţã de o anumitã secvenţã de aminoacizi, care are rol de epitop. Dar, uneori, anticorpii sunt specifici faţã de configuraţia spaţialã a unui determinant antigenic. Concluzia a reieşit din specificitatea distinctã a anticorpilor faţã de douã polipeptide sintetice cu aceiaşi compoziţie chimicã, dar cu configuraţii spaţiale diferite. In primul caz, determinantul antigenic este tripeptidul Tir-Ala-Glu, legat de un polimer sintetic, cu rol de purtãtor. La iepure, se sintetizeazã anticorpi specifici faţã de tripeptidul Tir-Ala-Glu.

În al II-lea caz, prin polimerizarea tripeptidului se obţine o moleculã cu structura periodicã a secvenţei Tir-Ala-Glu, care dobândeşte configuraţie α-helicalã. Dupã imunizarea iepurelui, se sintetizeazã anticorpi care precipitã moleculele cu structurã spaţialã α-helicalã, dar nu precipitã tripeptidul simplu. Pe baza acestor observaţii, M. Sela recunoaşte existenţa a douã tipuri de determinanţi antigenici:

-  determinanţi secvenţiali, a cãror specificitate este datã de secvenţa subunitãţilor componente (aminoacizi, monozaharide), indiferent de structura spaţialã a moleculei. Epitopii secvenţiali sunt comuni pentru toate polipeptidele care au secvenţe de aminoacizi identice sau asemãnãtoare şi existenţa lor este o sursã a reacţiilor imune încrucişate;

Fig. 7. Tipuri de epitopi. Epitopi secvenţiali şi conformaţionali, continui şi discontinui.

-  determinanţi antigenici conformaţionali, a cãror specificitate derivã din configuraţia spaţialã a moleculei. Epitopii conformaţionali sunt de douã feluri: continui şi discontinui. Cei discontinui sunt formaţi din regiuni distincte ale moleculei, care ajung în juxtapoziţie când molecula se pliazã în configuraţia sa nativã.

Menţinerea integritãţii determinanţilor conforma-ţionali este condiţionatã de integritatea legãturilor S-S. Dupã fragmentarea enzima-ticã a moleculei, epitopii conformaţionali discontinui îşi pierd integritatea şi semnificaţia funcţionalã, iar cei continui au o soartã variabilã: îşi pierd sau îşi pãstreazã configuraţia avutã în molecula nativã.

Importanţa epitopilor conformaţionali a fost evi-denţiatã pentru molecula de lizozim din albuşul de ou de gãinã. Bucla formatã de aminacizii 64-80 este închisã de o legãturã S-S între douã resturi de cisteinã. Secvenţa buclei a fost sintetizatã artificial şi legatã de polimerul Ala-Lys, cu rol de carrier. Complexul format induce sinteza anticorpilor la iepure, specifici faţã de aceastã secvenţã, dar dau reacţie de precipitare şi cu molecula nativã de lizozim.

Fig. 8. Bucla formatã din aminoacizii 64-80 ai secvenţei moleculei de lizozim din albuşul de ou, formeazã un determinant conformaţional.

În general, anticorpii care se sintetizeazã faţã de antigenele proteice naturale au specificitate, în primul rând, faţã de epitopii conformaţionali şi mai rar faţã de cei secvenţiali, ceea ce denotã cã sistemul imunitar recunoaşte molecula nativã sau regiuni ale ei, cu configuraţia spaţialã iniţialã.

În concluzie, studiul antigenelor sintetice a avut un rol decisiv pentru definirea condiţiilor de imunogenitate. Polizaharidele sunt molecule cu o slabã imunogenitate, corespunzãtoare unei complexitãţi moleculare limitate. Acizii nucleici şi lipidele sunt molecule neimunogene în stare nativã, dar dupã cuplarea cu un suport proteic, îndeplinesc rolul de haptene şi devin foarte imunogene. Din aceastã cauzã, nucleoproteinele şi lipoproteinele sunt antigene foarte eficiente. Proteinele native sunt imunogene, dar pentru exprimarea la un nivel superior a acestei proprietãţi, trebuie sã îndeplineascã condiţiile enumerate. Acestea, luate în parte, sunt necesare, dar nu suficiente. O bunã imunogenitate este rezultatul cumulãrii unui numãr cât mai mare de condiţii.

Un antigen ideal trebuie sã fie greu degradabil (pentru o persistenţã cât mai lungã în organism), sã fie timodependent şi sã aibã un numãr cât mai mare de semnale imunogene (epitopi), conectate într-un ansamblu funcţional, denumit imunon.  

Antigene endogene 

Antigenele endogene sunt componente celulare şi tisulare proprii (self), faţã de care, în condiţii normale, sistemul imunitar nu manifestã reactivitate. Totuşi, unele componente tisulare, în anumite condiţii, pot sã stimuleze reactivitatea imunitarã. Se disting douã categorii de antigene endogene: 1) antigene sechestrate (mascate) şi 2) antigene alterate.

Antigenele sechestrate sunt substanţe cu localizare intracelularã şi de aceea nu sunt accesibile sistemului imunitar pentru a fi recunoscute în cursul dezvoltãrii ontogenetice. Sub acţiunea unor factori (fizici, chimici, biologici), inductori ai unor procese de lizã celularã, moleculele cu localizare intracelularã se pot elibera şi sunt recunoscute ca nonself de sistemul imunitar. De exemplu, anticorpii antimitocondriali care caracterizeazã ciroza biliarã primitivã, se sintetizeazã dupã liza unor celule şi eliberarea acestor organite.

Alteori, unele componente tisulare sunt separate de sistemul imunitar, prin bariere anatomice:

-  proteinele cristalinului, delimitate de cristaloidã, se elibereazã în cursul intervenţiilor chirurgicale, dupã traumatisme care sparg capsula sau dupã afecţiuni care permeabilizeazã cristaloida. Ele sunt recunoscute ca molecule nonself şi stimuleazã rãspunsul imun anti-cristalin, ce poate afecta irisul, procesele ciliare şi coroida;

-  proteinele spermatice, în stãrile de spermostazã, induc sinteza localã a autoanticorpilor în structurile epididimului. Anticorpii recunosc specific un antigen al spermatozoizilor şi rezultatul este imobilizarea sau chiar aglutinarea, cu consecinţa sa, sterilitatea imunitarã;

-  caseina din lapte poate stimula reactivitatea autoimunitarã.

Antigenele alterate sunt molecule normale ale suprafeţei celulare, legate de membranã, care, din diferite cauze(uzurã fiziologicã sau sub acţiunea diferiţilor factori – fizici, chimici, biologici) îşi modificã structura chimicã şi sunt recunoscute ca molecule nonself. De exemplu, unele medicamente, dupã legarea cu diferite molecule din plasmã sau de pe suprafaţa eritrocitelor, le modificã conformaţia nativã şi acestea sunt recunoscute ca nonself. Virusurile induc sinteza în celula infectatã, a antigenelor proprii, dar adeseori moleculele specific virale determinã modificarea unor molecule self, care sunt recunoscute ca molecule strãine şi iniţiazã conflictul autoimun.

În condiţii normale, antigenele sechestrate şi alterate sunt neutralizate şi eliminate, fãrã consecinţe patologice. În 1900, Ehrlich a formulat conceptul “horror autotoxicus”, care semnificã preponderenţa acţiunii mecanismelor homeostatice. In condiţiile unei reactivitãţi imunitare crescute, activarea rãspunsului imun faţã de aceste componente chimice are drept consecinţe, declanşarea maladiilor autoimune, considerate ca fiind expresia patologicã a funcţiei imunitare.  

Antigene heterofile 

Antigenele heterofile sunt substanţe neidentice, dar înrudite chimic, prezente la numeroase specii de organisme: om, animale, plante, microorganisme. Particularitatea dominantã constã în faptul cã ele induc sinteza anticorpilor care dau reacţii încrucişate: anticorpii specifici faţã de un antigen al grupului heterofil, reacţioneazã (într-o reacţie de precipitare sau de aglutinare) cu oricare dintre antigenele grupului.

Prototipul antigenelor heterofile este antigenul de tip Forssman, descoperit în 1911 în ţesuturile de cobai. J. Forssman a descoperit cã serul imun obţinut prin imunizarea iepurelui cu omogenat tisular de cobai, aglutineazã eritrocitele de berbec. Este o reacţie încrucişatã, pe care autorul a denumit-o reacţie heterologã. Termenul “heterolog” s-a pãstrat pentru reacţiile încrucişate previzibile, pe care le manifestã diferite antigene înrudite (de exemplu, albumina sericã de om şi de primate). Denumirea “heterofil” s-a atribuit reacţiilor încrucişate pe care le produc antigene neînrudite.

Regnul animal poate fi împãrţit în specii Forssman pozitive (cobai, hamster, şoarece, oaie, caprã, cal, pisicã, câine, pui de gãinã etc.) şi specii Forssman negative (om, iepure, şobolan, maimuţe, bou, gâscã). Nici unele nici altele nu au vreun grad de înrudire geneticã.

Absenţa antigenului Forssman pe suprafaţa celulelor tisulare la iepure, este foarte importantã din punct de vedere practic. Serul imun anti-antigen Forssman se obţine prin imunizarea iepurelui cu o suspensie de hematii de berbec. In contact cu hematiile de berbec, serul imun obţinut pe iepure, produce aglutinarea lor, iar în prezenţa complementului se produce liza. Anticorpii specifici faţã de antigenele hematiei de berbec dau reacţie încrucişatã cu antigenele tisulare ale grupului Forssman, dar şi cu antigene de origine bacterianã. Antigene de tip Forssman s-au identificat ulterior, prin reacţii serologice, în celulele unor bacterii patogene (Str. pneumoniae, Shigella, Salmonella) şi chiar în celulele microbiotei din tractul digestiv, ceea ce explicã prezenţa anticorpilor naturali anti-hematie de berbec, în serul uman.

Reacţiile imune încrucişate pe care antigenele de tip Forssman le dau cu serul imun obţinut faţã de unul din antigenele grupului se explicã prin asemãnarea structurii chimice a acestor molecule. Cele mai multe antigene heterofile sunt glicoproteine sau glicolipide, în care grupãrile glucidice au rolul de haptene. Componentele glucidice ale antigenelor heterofile sunt foarte asemãnãtoare din punct de vedere chimic, chiar dacã aparţin unor organisme cu poziţie sistematicã foarte diferitã. Antigenul Forssman este un glico-sfingolipid, la care determinantul antigenic este format din douã resturi de N-acetil-galactozaminã.

Polizaharidele antigenelor de tip Forssman, în stare purificatã, nu sunt imunogene, sunt rezistente la fierbere şi chiar la autoclavare.

Cele mai importante sisteme heterofile sunt cele cu semnificaţie biologicã sau importanţã medicalã: sistemul Forssman, sistemul Paul-Bunnell (P-B) şi sistemul Hanganutziu-Deicher(H-D).

Anticorpii caracteristici mononucleozei infecţioase (Paul şi Bunnell, 1932) apar la 90% dintre pacienţii infectaţi cu virusul Epstein-Barr şi sunt IgM care se evidenţiazã într-o reacţie de aglutinare cu eritrocite de ovine sau bovine. Anticorpii serici recunosc douã antigene distincte: un antigen prezent numai pe eritrocitele bovine (B) şi un al II-lea antigen, existent atât pe eritrocitele de bovine cât şi pe cele de ovine (BS). Majoritatea pacienţilor cu mononucleozã infecţioasã sintetizeazã anticorpi anti-B şi anti-BS, dar o micã proporţie conţin numai anticorpi anti-B. Anticorpii P-B se sintetizeazã faţã de un antigen, ce pare a fi o glicoproteinã codificatã de virus.

Anticorpii H-D, descrişi de Hanganutziu (1924) şi Deicher (1926) sunt declanşatori ai maladiei serului, la pacienţii care au primit injecţii de ser heterolog. Sinteza lor este indusã de antigenul H-D, care se gãseşte în ţesuturile mamiferelor, dar lipseşte din ţesuturile normale umane, însã reapare în unele ţesuturi umane patologice (limfoame şi mieloame). Din punct de vedere chimic, antigenul H-D este acid N-glicolil-neuraminic. 

Alte antigene heterofile. Antigenele grupului Rh se gãsesc pe eritrocitele maimuţei Macaccus rhesus şi pe eritrocitele a circa 85% dintre indivizii umani.

Antigenul H  de pe eritrocitele umane de grup 0 este foarte asemãnãtor cu un polizaharid al celulelor de Yersinia pestis (agentul ciumei), iar antigenul eritrocitar uman de grup A este asemãnãtor cu un antigen al virusului variolei (smallpox). Dezavantajul asemãnãrii chimice dintre antigenele unor agenţi patogeni şi antigenele de grup sanguin este evident: indivizii umani de grup sanguin 0 şi A reacţioneazã mai slab la contactul cu antigenele asemãnãtoare, iar procesul infecţios se instaleazã mai rapid.

O importanţã practicã deosebitã au antigenele heterofile de T. pallidum şi cele de Proteus ^ox19. Fracţia majorã a anticorpilor specifici faţã de T. pallidum aglutineazã o suspensie de celule bacteriene de Proteus ^ox19. Aceiaşi fracţie a anticorpilor se combinã cu cardiolipina, ceea ce permite ca în reacţia de fixare a complementului pentru determinarea infecţiei cu T. pallidum sã se utilizeze antigenul cardiolipinic, mult mai uşor de obţinut. 

Adjuvanţii 

Substanţele sau amestecurile de substanţe, care în asociaţie cu un antigen sau injectate simultan cu acesta, intensificã rãspunsul imun specific faţã de antigenul respectiv sunt denumite adjuvanţi (adjuvere, latin = a ajuta).

Punctul de plecare al introducerii adjuvanţilor în practica imunologicã a fost un fapt de observaţie: dupã asocierea unui vaccin bacterian celular, cu un vaccin macromolecular (anatoxinã), rãspunsul imun antitoxinã este mult mai intens decât în cazul în care cele douã vaccinuri se administreazã separat. Dupã injectarea vaccinului celular anti-tifoparatific A şi B, împreunã cu anatoxina tetanicã (TAB), titrul anticorpilor faţã de anatoxina tetanicã este de 20-30 de ori mai mare decât în cazul injectãrii separate a anatoxinei tetanice. Explicaţia acestui fenomen  a fost datã ulterior: la locul injectãrii vaccinului, corpii celulari bacterieni determinã un proces inflamator, adicã un aflux local de celule efectoare ale rãspunsului imun (limfocite, macrofage). Macrofagele capteazã şi fixeazã anatoxina într-un stoc, de unde este eliberatã treptat şi astfel se prelungeşte durata de stimulare a sistemului imunitar.

Cel mai cunoscut şi folosit pentru studiul experimental al imunogenitãţii antigenelor este adjuvantul Freund, o emulsie1 de apã în ulei mineral de parafinã. Antigenul se suspendã în apã. Emulsia de apã în ulei se realizeazã cu un emulgator care conţine grupãri lipofile şi hidrofile (lanolina, arlacel A). Acesta este adjuvantul Freund incomplet. Dupã adãugarea celulelor omorâte de M. tuberculosis, rezultã adjuvantul Freund complet. Principiul imunostimulator al celulelor de M. tuberculosis este reprezentat de glicolipidele şi glicolipopeptidele(denumite ceruri) din structura peretelui celular. Glicolipopeptidele sunt formate din acizi micolici esterificaţi cu un polizaharid (arabinogalactan) ce conţine arabinozã, galactozã, manozã, la care se leagã un fragment peptidic ce conţine D şi L-alaninã, acid D-glutamic, acid diaminopimelic.

Fig. 9. Reprezentarea schematicã a interacţiunii moleculelor componente ale adjuvantului Freund.

Adjuvantul Freund determinã urmãtoarele efecte: a) persistenţa antigenului în organism prin întârzierea degradãrii sale şi eliberarea treptatã în circulaţie; b) picãturile de emulsie vehiculeazã antigenul pe cale limfaticã, în tot organismul, inclusiv spre ganglionii limfatici, unde se va declanşa rãspunsul imun; c) adjuvantul Freund complet şi incomplet fac imunogene doze mici de antigene, care altfel nu ar fi imunogene şi mãresc semnificativ titrul anticorpilor faţã de oricare antigen.

Amestecul de adjuvant şi antigen se administreazã subcutan sau intradermic. Administrarea intravenoasã anuleazã efectul adjuvantului. Este posibilã administrarea decalatã la interval de câteva zile (mai întâi a adjuvantului), dacã cele douã injectãri se fac în acelaşi loc.

Efectul stimulator al adjuvantului Freund este foarte intens pentru dozele mici de antigen. Este foarte eficient în asociaţie cu antigenele proteice, stimulând sinteza IgG. Utilizarea sa la om este limitatã de efectele secundare pe care le produce (artrita de adjuvant).

Endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Brucella, Bordetella etc.) au efect adjuvant. Ele sunt în acelaşi timp adjuvanţi, antigene, toxine şi factori pirogeni. Efectul maxim se obţine numai dacã endotoxina se administreazã simultan sau la mai puţin de 6 ore dupã injectarea antigenului. Nu se adaugã vaccinurilor umane pentru cã produce febrã.

Sãrurile de aluminiu (Al(OH)₃, Al(SO₄)₂. 12 H₂O), fosfatul de aluminiu) şi cele de calciu au efect adjuvant, deoarece se combinã cu imunogenul şi formeazã un complex insolubil la situsul subcutan sau intramuscular al injectãrii, mãrind intervalul de timp în care celulele imunitare pot fi activate. Se stimuleazã afluxul de fagocite şi funcţia de fagocitozã.

Compuşii aluminiului sunt singurii adjuvanţi acceptaţi în clinica umanã şi veterinarã, deşi prezintã unele dezavantaje: stimuleazã rãspunsul imun mediat humoral, dar nu şi imunitatea mediatã celular; vaccinurile care conţin compuşi ai Al nu pot fi conservate prin îngheţ şi nici liofilizate şi de aceea necesitã transport refrigerat.

Alţi adjuvanţi acţioneazã prin stimularea activitãţii enzimelor lizosomale. Vitamina A şi sãrurile de beriliu, de siliciu, sãrurile quaternare de amoniu mobilizeazã macrofagele la locul injectãrii şi stimuleazã activitatea lor fagocitarã şi degradativã.