Limfocitele T şi B se diferenţiazã dintr-o celulã stem (celulã mamã, tulpinã, de origine), care nu a fost identificatã, fiind doar ipoteticã, deoarece nu are caractere structurale distinctive.

Celula stem este de origine mezenhimalã. La pãsãri şi mamifere, celula stem apare în mezenhimul paraaortic al embrionului, având un potenţial foarte înalt de multiplicare şi diferenţiere.

Celula stem este pluripotentã, chiar totipotentã, deoarece prin multiplicare şi diferenţiere, genereazã toate categoriile de celule sanguine: granulocite, monocite, limfocite, mastocite, megacariocite, eritrocite. Diferenţierea iniţialã a celulei stem este pe linie eritrocitarã şi mieloidã, iar diferenţierea pe linie limfoidã este ulterioarã şi simultanã cu procesul de maturare.

Maturarea limfocitelor semnificã dobândirea imunocompetenţei, adicã a capacitãţii de a recunoaşte specific antigenul şi de a se activa.

Din mezenhimul paraaortic, celula stem migreazã în sacul vitelin, unde, pentru un interval de timp se desfãşoarã hematopoeza.

   Sacul vitelin este sediul esenţial al diferenţierii celulelor stem pe cale limfoidã, la pãsãri şi mamifere, înainte de migrarea lor în ficat şi splinã. Dupã cultivarea embrionului total de şoarece, fãrã sacul vitelin, înainte de migrarea şi colonizarea sa cu celule stem limfoide,  nu s-a evidenţiat diferenţiere celularã pe cale limfoidã. Ulterior în viaţa embrionarã, funcţia hematopoeticã este preluatã de ficat şi splinã. In aceste organe, celulele stem se divid cu o ratã înaltã şi se diferenţiazã pe linie eritrocitarã, mieloidã (granulocitarã), monocitarã, limfoidã.

În ultima parte a vieţii embrionare, funcţia hematopoeticã este preluatã de mãduva osoasã, chiar dacã ficatul şi splina pãstreazã o activitate hematopoeticã foarte limitatã şi un scurt interval dupã naştere.

Celulele limfoide diferenţiate în mãduva osoasã, la pãsãri, migreazã iniţial în splinã şi ficat, iar de aici migreazã în organele limfoide centrale (timus şi bursa lui Fabricius).

La mamifere, din mãduva osoasã, limfocitele migreazã în ficat şi splinã. Unele îşi dobândesc competenţa imunitarã chiar în mãduva osoasã, în ficat sau în splinã, organe care îndeplinesc funcţiile bursei la pãsãri, iar altele migreazã în timus. Acesta este circuitul primar al limfocitelor, în care se produce diferenţierea independentã de antigen, în cursul cãreia limfocitele devin imunocompetente. Aceastã etapã se desfãşoarã în organele limfoide primare (timus, bursa lui Fabricius şi echivalenţii bursali ai mamiferelor). In cursul ei, limfocitele dobândesc receptori specifici de antigen. 

Fig. 33. Diferenţierea celulelor stem   în limfocite T şi B are loc în timus şi respectiv, în mãduva osoasã. Limfocitele mature migreazã în ţesuturile limfoide (dupã Black, 1996).

Fig. 34. Un model al cãilor de diferenţiere a celulelor sanguine din celulele stem hematopoetice, în raport cu condiţiile de mediu. Celulele stem şi cele imature sunt delimitate de linii întrerupte (dupã Ikuta, 1992).

A II-a fazã a diferenţierii limfocitelor este dependentã de antigen şi se produce în circuitul secundar. Limfocitele imunocompetente trec în circuitul sanguin şi de aici migreazã în ţesuturile limfoide secundare, de unde, pe cale limfaticã se reîntorc în sânge. In circuitul secundar, limfocitele au şansa întâlnirii cu antigenul specific receptorului lor, se activeazã, prolifereazã şi se diferenţiazã spre stadiile de celule efectoare şi celule cu memorie. 

Fig. 35. Diferenţierea limfocitelor are loc în douã etape: 1) diferenţierea independentã de antigen în mãduva  osoasã şi în organele limfoide primare; 2) diferenţierea dependentã de  antigen în organele limfoide secundare.

Mecanismele moleculare care condiţioneazã migrarea limfocitelor din splinã şi ficat, în organele limfoide primare, nu se cunosc. Este un proces aleatoriu sau este programat de receptori celulari, eventual dobândiţi în aceste organe. Dacã este un proces condiţionat, înseamnã cã în ficat, celulele limfoide sunt deja pre-B (prebursocite) şi vor migra în bursa lui Fabricius şi respectiv pre-T (pretimocite), care vor migra în timus. 

Rolul bursei lui Fabricius în diferenţierea limfocitelor B 

Bursa lui Fabricius este un organ limfoepitelial şi se dezvoltã ca un diverticul dorsal al intestinului terminal, situat lângã cloacã. Primordiul bursal se observã la embrionul de 4 zile de incubaţie, ca un mugure epitelial în regiunea cloacalã. Pe mãsurã ce creşte, mugurele se vacuolizeazã şi vacuolele prin coalescenţã, formeazã lumenul bursal. Pe suprafaţa internã a cavitãţii bursale, epiteliul formeazã pliuri longitudinale, prolifereazã şi constituie aglomerãri celulare (muguri epiteliali) în lamina propria. Formarea mugurilor epiteliali este dependentã de interacţiunea celulelor epiteliale cu ţesutul mezenhimal. Celulele stem limfoide din sacul vitelin colonizeazã mugurele epitelial în zilele 8-11 de dezvoltare embrionarã. Fiecare mugure epitelial este colonizat de 1-3 celule stem limfoide prebursale. Celulele limfoide prolifereazã intens şi formeazã medula foliculilor bursali.

Atât celulele epiteliale ale bursei cât şi celulele stem ale liniei limfoide prolifereazã intens în cursul vieţii embrionare, dar şi 2-4 sãptãmâni dupã ecloziune. La 4 sãptãmâni dupã ecloziune, bursa conţine circa 10 000 de foliculi, fiecare având circa 10⁵ limfocite.

Celulele stem limfoide prebursale sunt originare în mezenhimul embrionar. Înainte de a ajunge în bursã, genele pentru sinteza imunoglobulinelor s-au rearanjat, fiind angajate în dezvoltarea pe linia B. La 12 zile de incubare, în interiorul bursei apar celule care exprimã IgM membranar, iar la ecloziune, circa 90% din celulele bursale au IgM pe suprafaţa lor şi sub 1% exprimã IgG sau IgA.

Celulele epiteliale din zona medularã formeazã o reţea laxã, având o structurã internã de tip secretor. In zona medularã, pe lângã celulele epiteliale se gãsesc limfocite, plasmocite, fagocite. Regiunea medularã şi cea corticalã sunt separate prin membrana bazalã. La suprafaţa lumenului bursal, celulele epiteliale se diferenţiazã în epiteliul asociat foliculului, cu funcţia de a fagocita şi de a transporta materialul antigenic, din lumenul bursal, în regiunea medularã. Celulele epiteliale din epiteliul asociat foliculilor şi cele din medula bursalã sunt diferite în privinţa capacitãţii de a fagocita şi a activitãţii enzimatice.

La ecloziune, bursa are 30-40 mg, atinge dezvoltarea maximã (3-4 g) la 2-4 luni şi se menţine pânã la 4-6 luni, când începe sã involueze şi se atrofiazã la maturitatea sexualã, când dispar complet structurile limfoide şi epiteliale.

Bursectomia la ecloziune nu împiedicã migrarea limfocitelor B la periferie, pentru cã procesul începe timpuriu în dezvoltarea embrionarã. Îndepãrtarea chirurgicalã a primordiului sau ablaţia chimicã a epiteliului bursal prin tratament cu testosteron, se poate face la 2-5 zile de incubare, înainte ca foliculii bursali sã fie populaţi de celulele stem limfoide. La pasãrea adultã timectomizatã, numãrul de limfocite B în organele limfoide periferice nu este influenţat. Se gãsesc plasmocite şi anticorpi, dar cu un repertoriu foarte limitat al specificitãţii de legare, ceea ce denotã o maturare extrabursalã foarte limitatã a limfocitelor B. Concluzia este cã bursa lui Fabricius nu este strict necesarã pentru asamblarea genelor codificatoare ale sintezei imunoglobulinelor şi nici pentru diferenţierea limfocitelor B, dar are un rol esenţial pentru diversificarea clonalã a limfocitelor B, adicã pentru diversificarea repertoriului lor antigenic.

Bursa lui Fabricius este un organ limfoid specializat în care se produce diversificarea somaticã extensivã a genelor rearanjate pentru sinteza anticorpilor, cât şi expansiunea clonalã a limfocitelor.

Spre deosebire de mamifere, la care generarea diversitãţii celor circa 10⁹  specificitãţi de legare a anticorpilor se face prin legarea combinatorialã a segmentelor genice V-D-J (pentru catena H) şi a segmentelor genice V-J (pentru catena L), linia avianã de evoluţie a vertebratelor a exploatat o altã strategie pentru generarea diversitãţii specificitãţii de legare a moleculelor de anticorpi. In timpul dezvoltãrii embrionare a puiului de gãinã, potenţialul generãrii diversitãţii genetice prin procese de recombinare genicã este limitat, deoarece regiunea variabilã a catenei H şi a catenei L este codificatã de secvenţe genice funcţionale unice V şi J. Conversia genicã are loc cu o ratã mare între singura genã funcţionalã V (VH₁ sau VL₁) şi un grup de pseudogene V. De aceea, rearanjarea genelor în celulele embrionare ale liniei limfoide, înainte de migrarea în bursã, va produce o diversitate foarte limitatã a specificitãţii de legare a anticorpilor. Micromediul bursal selecteazã şi favorizeazã diferenţierea celulelor stem bursale care suferã o conversie genicã productivã, iar celelalte (circa 90%), probabil cu conversie neproductivã, mor prin apoptozã în interiorul bursei.

Între celulele epiteliale ale bursei şi celulele liniei limfoide se stabilesc interacţiuni foarte strânse, esenţiale pentru diversificarea specificitãţii antigenice a limfocitelor B. Efectul bursei este mediat de factori humorali, ca de exemplu, bursopoetina, un polipeptid mic, capabil sã inducã diferenţierea limfocitelor B in vitro.  

Diferenţierea limfocitelor B la mamifere 

Diferenţierea liniei celulare B este ulterioarã diferenţierii liniilor eritrocitarã şi mieloidã.

La mamifere, primul organ în care are loc diferenţierea celulelor B, este ficatul fetal. Iniţial, ficatul primeşte celule precursoare ale liniei limfoide generate în sacul vitelin, dar ulterior el însuşi devine sediul funcţiei hematopoetice. Aceiaşi funcţie de stimulare a diferenţierii limfocitelor B ar avea-o splina fetalã şi chiar sângele circulant, care strãbãtând diferite organe dobândeşte capacitatea de a induce maturarea limfocitelor B.

Studiul diferenţierii limfocitelor B în ficatul fetal este îngreunat, deoarece ficatul nu se poate extirpa (aşa cum se pot extirpa timusul şi bursa lui Fabricius), iar numãrul limfocitelor este mic comparativ cu al celulelor liniei eritrocitare.

Celulele precursoare ale liniei B generate în ficatul embrionar şi ulterior în mãduva osoasã, nu exprimã markeri imunoglobulinici de suprafaţã. Ele îşi dobândesc competenţa imunitarã în mãduvã, în ficat sau în splinã. Maturarea (dobândirea competenţei) constã în exprimarea receptorului imunoglobulinic membranar. In genomul lor are loc rearanjarea genelor V, D, J ale catenei H. Odatã cu rearanjarea genicã, limfocitele suferã o tranziţie rapidã şi devin limfoblaste mari, care se divid. Prin diviziune rezultã celule pre-B mici, care exprimã catena μîn citoplasmã, dar nu exprimã Ig de membranã (μ cit⁺, L^-, Igm^-). Ulterior se rearanjeazã genele k ale catenei L şi numai dacã genele k nu se rearanjeazã cu succes, se recombinã genele α. Dupã sinteza catenei L, moleculele de imunoglobulinã se exprimã pe suprafaţa limfocitului.

Rearanjarea într-o combinaţie funcţionalã a genelor unuia din cei doi cromosomi, împiedicã recombinarea genelor în cromosomul pereche, sugerând o explicaţie pentru fenomenul excluderii alelice.

Prima imunoglobulinã de suprafaţã a limfocitelor B este IgM, ca proteinã integratã, cu o densitate de peste 200 000 de molecule/celulã. Limfocitele B care exprimã pe suprafaţa lor numai molecule IgM sunt considerate imature. Alãturi de IgM pot sã coexiste IgA sau IgG. Pe mãsurã ce diferenţierea limfocitelor B progreseazã, alãturi de IgM apare IgD, care treptat devine dominantã cantitativ. Limfocitele B mature, în repaus (neangajate) au pe suprafaţa lor, nivele mai înalte de IgD decât IgM. Acestea sunt celule imunocompetente.

Limfocitele B care nu reuşesc sã genereze o rearanjare funcţionalã a genelor pentru sinteza catenelor H şi L, sunt eliminate într-un stadiu timpuriu al diferenţierii lor.

Dupã stimularea antigenicã, limfocitele B mature secretã IgM,  IgG (una din subclase), IgA sau IgE. Nu se diferenţiazã o linie celularã care sã sintetizeze izotipul IgD.  

Timusul la mamifere şi rolul lui în diferenţierea limfocitelor T 

Timusul este un organ limfoid voluminos, aşezat în partea superioarã a mediastinului anterior. Are origine epitelialã dublã: derivã din ectodermul perechii a III-a de pungi branhiale şi din endodermul celei de III-a pungi faringiene. Primordiile epiteliale fuzioneazã şi formeazã primordiul timic epitelial, care pierde legãtura cu faringele şi lumenul dispare.

Timusul este primul organ limfoid care apare la pãsãri şi mamifere. Primordiul timic este strãpuns de celulele stem limfoide (la şoarece, în ziua a 11-a de dezvoltare embrionarã), cu originea în sacul vitelin. Ulterior în cursul dezvoltãrii fetale, celulele limfoide vin din ficat, iar dupã naştere, din mãduva osoasã. La fãtul uman, la 20 de sãptãmâni de sarcinã, timusul este dezvoltat complet. 

Arhitectura timusului 

Timusul este alcãtuit din doi lobi. Fiecare lob este împãrţit incomplet, prin septuri conjunctive, în lobuli. Lobulii conţin o reţea de celule epiteliale, printre care sunt diseminate numeroase celule limfoide (timocite).

  Epiteliul timic este diferenţiat zonal: zona corticalã şi zona medularã.

Fig. 36. Componentele stromale ale micromediului timic.

La animalele tinere, zona corticalã formeazã 80% din ţesutul timic. Celulele epiteliale sunt de formã stelatã, cu numeroase prelungiri fine care se interconecteazã, formând un citoreticulum. Numãrul limfocitelor este mai mare decât al celulelor epiteliale. Limfocitele sunt mici şi pe secţiunile colorate cu hematoxilinã, zona corticalã este întunecatã, datoritã raportului nucleo-citoplasmatic  înalt al limfocitelor imature. Majoritatea limfocitelor(80-85%) sunt imature, dublu pozitive (exprimã nivele înalte ale moleculelor CD₄ şi CD₈) şi au un nivel scãzut de molecule RCT. Ele stau în ochiurile unei reţele de celule epiteliale şi celule dendritice care exprimã molecule CMH. Moleculele CMH au rol esenţial în selecţia pozitivã a limfocitelor, adicã maturarea lor în celule T mature. O micã proporţie a limfocitelor sunt blaste.

Zona medularã este formatã dintr-o reţea densã de celule epiteliale mai mari, de formã ovoidã, cu prelungiri citoplasmatice scurte, bogate în organite secretoare. În ochiurile reţelei se gãseşte un amestec de limfocite cu un singur marker, CD₄⁺ sau CD₈⁺, dar exprimã RCT α-β, cu o densitate net superioarã. Raportul celulelor CD₄⁺/CD₈⁺ este 2/1. Limfocitele sunt situate printre celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, interdigitate şi macrofage). Un numãr mic (sub 1%) de limfocite timice exprimã RCT γ-δ, diseminate în cortex şi medula.

În zona medularã apar douã tipuri de structuri, derivate din celule epiteliale: corpusculii Hassal formaţi din celule epiteliale dispuse concentric, cu aspect general de degenerescenţã şi cavitãţile chistice, cãptuşite de celule epiteliale columnare prevãzute cu microvili.  

Fig. 37. Reprezentare schematicã a arhitecturii generale a timusului. Subregiunile timusului sunt prezentate în dreapta figurii, iar constituienţii lor celulari, în stânga (dupã Hood şi colab., 1984).

Timusul este bogat inervat, cu fibre adrenergice şi colinergice, iar neurotransmiţãtorii oxitocina, vasopresina şi neurofizina sunt sintetizaţi endogen de celulele perivasculare medulare şi de celulele “nurse”(celule epiteliale mari, asociate cu un numãr mare de limfocite), ceea ce sugereazã raporturile strânse ale timusului cu sistemul nervos.

În raport cu distribuţia limfocitelor, timusul are 4 regiuni funcţionale:

-  regiunea subcapsularã, bogatã în limfocite imature (pre-T), abia intrate în timus;

-  cortexul timic, în care limfocitele se divid cu o ratã înaltã;

-  joncţiunea cortico-medularã, formatã dintr-un cordon de macrofage “santinelã”, cu rolul unei site celulare;

-  regiunea medularã, cu relativ puţine limfocite, care poartã markerii de suprafaţã proprii limfocitelor mature.

Timusul evolueazã, atingând adeseori o dezvoltare maximã odatã cu maturitatea sexualã, dupã care începe involuţia, asociatã cu sensibilitatea sa la hormonii steroizi. La şoarece, involuţia începe la 6 sãptãmâni. La om, involuţia timicã începe dupã pubertate, ţesutul reducându-se cu circa 3% pe an, pânã la 35-40 de ani şi cu 1% pe an dupã aceea. Dimensiunile nu se reduc, deoarece ţesutul timic este înlocuit de ţesut gras.

Atrofia glandei timice poate fi acceleratã de corticosteroizi. Producerea unor cantitãţi crescute de corticosteroizi sau terapia cu corticosteroizi accelereazã atrofia timicã. Fenomenul se numeşte involuţie de stress, pentru cã nivelul de corticosteroizi creşte în stãrile de stress şi în cele clinice. Steroizii au acţiune citoliticã asupra timocitelor corticale. Limfocitele medulare sunt relativ rezistente, datoritã enzimei 20 α-hidroxil steroid-dehidrogenazei. 

Maturarea limfocitelor T în timus 

Dezvoltarea repertoriului limfocitelor T, este un proces complex de evenimente de selecţie pozitivã şi negativã, ce implicã interacţiunea moleculelor de suprafaţã şi necesitã influenţa micromediului timic. Limfocitele T au raporturi spaţiale strânse cu celulele stromale epiteliale. Acestea furnizeazã "semnale educaţionale" care orienteazã maturarea limfocitelor în douã direcţii:

-  dobândirea RCT şi a capacitãţii de a recunoaşte antigenele exogene;

-  dobândirea toleranţei faţã de self;

-  eliminarea celulelor T self-reactive, precum şi a celor care nu genereazã combinaţia genicã a unui receptor funcţional.

Celulele pre-T se diferenţiazã în ficatul fetal şi în mãduva osoasã. Ele conţin o enzimã specificã - terminal deoxynucleotidil-transferaza (TdT) - cu localizare nuclearã. In cortexul timic, limfocitele pre-T exprimã markerii CD₂ şi CD₃ pe membrana citoplasmaticã. Pe mãsurã ce maturarea progreseazã, limfocitele fiind încã în cortexul timic, exprimã markerii CD₄ şi CD₈. Dupã expresia la micã densitate a moleculelor CD₄ şi CD₈, se rearanjeazã  genele care codificã RCT şi celulele devin triplu pozitive(RCT⁺, CD₄⁺, CD₈⁺). Acestea suferã procesele de selecţie, prin care se eliminã celulele T autoreactive şi se selecteazã celulele care recunosc moleculele CMH I şi CMH II. Când limfocitul T imatur migreazã în zona medularã, se pierde fie markerul CD₄, fie CD₈. În acest stadiu dispare markerul TdT.

Celulele CD₄ ⁺ şi CD₈⁺ se dezvoltã din celule progenitoare dublu pozitive pentru cei doi markeri, iar acestea îşi au originea în celule dublu negative.

Dobândirea toleranţei faţã de self. În zona corticalã a timusului, limfocitele “învaţã” sã tolereze selful, fenomen ce constã în selecţia celulelor care recunosc moleculele CMH exprimate pe suprafaţa celulelor epiteliale. Aproximativ 90% dintre celulele pre-T care ajung în zona corticalã, nu reuşesc sã traverseze joncţiunea cortico-medularã. Ele sunt supuse unui proces de selecţie pozitivã ce constã în supravieţuirea limfocitelor care recunosc moleculele CMH ale celulelor epiteliale. Selecţia pozitivã constã în supravieţuirea limfocitelor care recunosc şi interacţioneazã cu afinitate medie, cu moleculele CMH. Limfocitele care nu genereazã un receptor care sã recunoascã moleculele CMH, ca şi cele care leagã cu mare afinitate  moleculele CMH, potenţial inductoare ale conflictelor autoimune (selecţie negativã), sunt eliminate prin apoptozã.

În zona medularã, selecţia limfocitelor continuã, prin eliminarea clonelor reactive faţã de self. Medula timicã are particularitãţi funcţionale proprii, care favorizeazã inducerea toleranţei faţã de self. In contrast cu cortexul, medula este deschisã circulaţiei libere a proteinelor de origine sanguinã şi în structura ei se gãsesc CPA (celule prezentatoare de antigen) originare în mãduva osoasã (macrofage, celule dendritice, şi interdigitate). Aceasta semnificã faptul cã moleculele self din sânge ajung în timus şi induc toleranţa celulelor T imature. Moleculele self care nu intrã în sânge (de exemplu, moleculele tisulare), nu ajung în timus şi nu induc selecţia negativã. Faţã de aceste molecule este posibilã întreruperea stãrii de toleranţã.

Fig.38. Diferenţierea celulelor T în timus. Celulele autoreactive cu specificitate pentru antigenele self neexprimate în timus, pot sã devinã tolerante prin contactul extratimic cu antigenele. TCR1 = receptor γ, δ; pre-TCR2 = receptor pre-T α, β; TCR2 = receptor matur α, β; TdT = terminal deoxinucleotidil transferaza (dupã Roitt, 1997, modificatã).

Prin selecţie negativã, în zona medularã, sunt eliminate limfocitele T self-reactive, adicã cele cu potenţialul de a se activa faţã de antigenele self asociate moleculelor CMH. Eliminarea acestor celule este esenţialã pentru inducerea toleranţei faţã de self. Sunt de asemenea eliminate celulele T care nu genereazã o combinaţie genicã pentru codificarea unui receptor funcţional de antigen. Se matureazã limfocitele care genereazã receptori specifici faţã de epitopii nonself.

Selecţia negativã este dependentã de cantitatea de antigen ce ajunge în timus. De exemplu, un antigen abundent (albumina) realizeazã o concentraţie mare în timus şi determinã o selecţie negativã completã, adicã eliminã întregul spectru de limfocite T – cu receptori de înaltã şi joasã afinitate. De aceea, toleranţa faţã de albuminã nu va fi niciodatã întreruptã şi nu se cunosc maladii autoimune cu reactivitate limfocitarã faţã de albuminã. Alte molecule pãtrund în timus, în cantitãţi mici, pe cale sanguinã(de exemplu, insulina) şi selecţia negativã este incompletã, adicã sunt eliminate numai celulele T cu receptor de mare afinitate pentru antigen. In condiţii experimentale, prin injectarea antigenului la concentraţii mari, toleranţa faţã de aceste molecule poate fi întreruptã şi se poate stimula reactivitatea autoimunã.

Se considerã cã exprimarea RCT şi a moleculei CD₄, ce interacţioneazã cu moleculele CMH II, inhibã exprimarea moleculelor CD₈, sau  diferenţierea celulelor cu un singur marker(CD₄ ori CD₈) este un proces stochastic.

Rezultatul final al diferenţierii limfocitelor T în timus, constã în generarea receptorilor celulelor T, cu capacitatea de a tolera selful, asociat cu moleculele CMH, şi de a reacţiona la moleculele nonself, ceea ce este esenţial pentru interacţiunile celulare în cursul elaborãrii rãspunsului imun.

Numãrul celulelor T mature în organele limfoide secundare rãmâne constant, la o valoare ridicatã, în condiţiile în care timusul involueazã treptat. Constanţa numericã a celulelor T este atribuitã duratei lungi de viaţã a acestor limfocite, dar nu este exclusã producerea de novo  în alte ţesuturi (intestin, ficat, mãduvã osoasã).  

Factorii celulari şi humorali ai diferenţierii limfocitelor 

Pe baza datelor experimentale acumulate se poate deduce existenţa a cel puţin douã mecanisme active asupra diferenţierii limfocitelor în organele limfoide centrale. Mecanismele propuse nu se exclud. Coexistenţa şi sinergismul lor demonstreazã importanţa organelor limfoide centrale în controlul procesului de diferenţiere şi complexitatea acestuia. Majoritatea cercetãrilor au vizat  factorii de diferenţiere ai timusului, dar rezultatele pot fi extrapolate asupra factorilor bursali ai diferenţierii limfocitelor B la pãsãri.

S-au conturat douã ipoteze referitoare la factorii de diferenţiere ai limfocitelor: ipoteza celularã şi ipoteza hormonalã (humoralã).

În acord cu ipoteza celularã a micromediului epitelial al timusului, diferenţierea limfocitelor T s-ar realiza prin contactul direct al pretimocitelor cu epiteliul timic. Experienţele de extirpare a timusului la animalele nou nãscute, cu sistem imunitar imatur au evidenţiat cã prezenţa timusului funcţional este o condiţie esenţialã pentru funcţia optimã a imunitãţii mediate celular. Extirparea timusului la animalele nou-nãscute este urmatã de instalarea “sindromului de epuizare”(Miller, 1961), ale cãrui simptome se manifestã progresiv mai intens şi în esenţã reflectã incapacitatea organismului de a se apãra faţã de infecţiile virale şi fungice (disfuncţia imunitãţii mediate celular). Grefa timusului (de la organisme singenice) le restabileşte treptat starea normalã.

Extirparea timusului la organisme mature a evidenţiat cã absenţa timusului este compatibilã cu viaţa, fãrã manifestarea unor deficienţe notabile. S-a dedus astfel, cã mecanismele celulare de contact al limfocitelor cu celulele epiteliului timic ar fi active numai în primele faze ale maturãrii limfocitelor T, dar absolut necesare pentru diferenţierea lor.

Dupã datele actuale, mecanismul celular al influenţei timice nu este suficient pentru diferenţierea celulelor T. S-a emis ipoteza hormonalã, care considerã cã procesul de diferenţiere şi maturare imunitarã ar continua dupã ce timocitele pãrãsesc timusul. Hormonul secretat de celulele epiteliului timic ar exercita o acţiune stimulatoare asupra diferenţierii limfocitelor, atât intratimic cât şi la distanţã, dupã trecerea sa în circulaţie, asupra celulelor limfoide circulante sau localizate în organele limfoide secundare, continuând astfel influenţa directã a epiteliului timic.

În favoarea existenţei unui factor hormonal timic s-au adus argumente experimentale, care pot fi grupate în douã categorii:

a) Experienţe de restabilire a funcţiei imunitare sub acţiunea factorilor timici: de exemplu, îndepãrtarea timusului la şoarecele nou-nãscut este urmatã de pierderea imunitãţii mediate celular. Implantarea subtegumentarã a unei grefe de timus, plasatã într-o camerã specialã cu pereţi poroşi, permeabilã pentru molecule, dar impermeabilã pentru celule, restabileşte imunocompetenţa, ceea ce demonstreazã cã nu este strict necesar contactul limfocitelor cu celulele epiteliului timic. Este suficient ca mediatorul (mediatorii) chimic secretat de timus sã fie prezent în organism pentru a se produce maturarea limfocitelor T. Pe de altã parte, şoarecii-femele timectomizate la naştere, îşi recapãtã competenţa imunitarã în timpul sarcinii, sub influenţa hormonilor timici fetali, care trec în circulaţia maternã.

b) Evidenţierea factorilor timici prin metode biochimice: unii hormoni au fost izolaţi din timus, iar alţii din sânge. Nu sunt întru-totul asemãnãtori hormonilor convenţionali, pentru cã nu se pot substitui complet ţesutului timic şi pentru faptul cã unele molecule din categoria hormonilor timici pot fi generate şi în alte ţesuturi. Factorii serici de origine timicã dispar dupã timectomie şi reapar dupã grefa de timus. Existenţa factorilor serici de origine timicã argumenteazã în favoarea ipotezei cã imunocompetenţa se dobândeşte atât în faza timicã a limfocitelor, cât şi la distanţã, dupã ce limfocitele au pãrãsit timusul. 

Denumirea factorilor de imunocompetenţã variazã mult, în funcţie de origine, proprietãţi biochimice, efecte biologice.

Din timusul de viţel s-au extras câteva polipeptide, iar unele s-au preparat pe cale sinteticã. O serie de componente manifestã activitate imunobiologicã: timulina, timopoetina, timozinele.

Timozinele (evidenţiate de Goldstein) din cea de 5-a  fracţie proteicã de extract timic de viţel, reprezintã un grup de polipeptide cu greutatea molecularã cuprinsã între 1000 şi 15 000 D, stabile la 80^o. Prin combinarea metodelor analitice de cromatografie analiticã şi gel-filtrare, din aceastã fracţie s-au izolat 16 polipeptide. Ele induc, in vitro, sinteza MIF de cãtre limfocite, precum şi diferenţierea celulelor formatoare de anticorpi. De asemenea, timozinele restabilesc funcţiile imunitare la animalele timectomizate neonatal şi la persoanele vârstnice, la care competenţa imunitarã diminuã datoritã involuţiei timusului. Din acest amestec de polipeptide, cel mai activ este un polipeptid de 108 aminoacizi (12 kD), a cãrui secvenţã a fost determinatã.

Timopoetina este un hormon polipeptidic al timusului de viţel, izolat de Goldstein, format din 49 de aminoacizi, evidenţiat în primul rând datoritã efectelor sale asupra transmiterii neuromusculare şi mai puţin prin efectele sale asupra sistemului imunitar. Bolnavii atinşi de myasthenia gravis prezintã, de regulã, o hiperplazie timicã (timom). S-a creat sistemul experimental al acestei maladii, ceea ce a permis izolarea unui polipeptid care modificã transmiterea neuromuscularã, iar la indivizii bolnavi provoacã oboseala muscularã. S-au identificat douã variante de timopoetinã, care diferã prin doi aminoacizi şi stimuleazã activitatea limfocitelor T.

Timulina (Factorul timic seric, FTS) s-a izolat din serul uman, din serul de porc şi din timusul de viţel. In acord cu criteriile clasice ale endocrinologiei şi fiziologiei, timulina este singurul polipeptid de origine timicã recunoscut ca hormon, adicã este secretatã şi reglatã de timus.        

Timulina lipseşte în serul şoarecelui nud, iar la animalele convenţionale, dispare dupã timectomie, dar reapare dupã grefa timicã. Este un peptid cu greutatea molecularã de 900 D, cu urmãtoarea secvenţã a celor 9 aminoacizi: Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn. Concentraţia FTS depinde de vârstã şi scade odatã cu scãderea greutãţii timusului. Timulina are activitate biologicã numai când este cuplatã equimolar cu Zn. Echilibrul Zn este alterat la vârstnici.

Se pare cã hormonii timici acţioneazã asupra limfocitelor T, dupã ce acestea au pãrãsit timusul. Efectul lor stimulator se exercitã asupra tuturor categoriilor funcţionale de limfocite T: helper, citotoxice, supresoare.

Ubiquitina este un polipeptid ce conţine 74 de aminoacizi (8,4 kD) care se gãseşte în timus şi în majoritatea ţesuturilor la animale şi chiar la plante. In vitro, stimuleazã diferenţierea limfocitelor precursoare ale liniei T şi B, ceea ce explicã pãstrarea funcţiei imunitare dupã timectomizarea animalelor mature.