Dumitru Mişcalencu, Lăcrămioara Ivanciu, Florica Mailat, Cristina Bordea, Oncogene virale

 

ONCOGENA SRC 

VIRUSULSARCOMULUIROUS (RSV)

 

Oncogena v-src din virusul Rous este localizată la capătul 3'LTR din genomul viral, īn continuarea genelor standard gag, pol şi env. Īn genomul păsărilor şi mamiferelor este prezent omologul său celular c-src. Produsul genei este o fosfoproteină de 60kD- pp60v-src, care aparţine familiei protein-kinazelor src.

Īn celulele proliferante ale neuroretinei de la pui, īn cursultransformării de către RSV s-au demonstrat activitatea mitogenică şi proprietăţile kinazice ale ppv-src (1).

Oncogena v-src are un īnalt potenţial ocogenic īn trnsformarea celulelor mamaliene. Tulpina Schmidt-Ruppin transformă celulele de şobolan de 100 ori mai eficient decāt tulpina parentală. Celulele BRL obţinute din ficatul de şobolan au generat 5 clone transformate, caracterizate prin pierderea fibronectinei de la suprafaţa celulelor modificate morfologic (2,3).

mRNAv-src nu include secvenţe derivate din c-src, aşa īncāt,mRNA codificat de v-src şi v-src' (v-src' este un fragment din gena c-src care se adaugă la v-src), formează proteina de 59.000 gm constituită din 526 reziduuri de amino-acizi din care 514 aparţin oncogenei v-src, iar 12 lui v-src'. Produsul translaţional conţine proteina de 60kD(pp60v-src). Produsul c-src īn concentraţii oricāt de mari nu produce transformarea celulelor dar modificările indusela COOH-terminal produc proteina v-src cu potenţial oncogenic activ. Pentru transformarea genei c-src īn v-src sunt necesare modificări atāt calitative cāt şi cantitative. Ambele proteine manifestă activitate protein-kinazică, ele cuplāndu-se la plasmalemă prin acidul miristic. Ele se fosforilează la Ser-117 dar cu nuanţe diferite impuse de structurile COOH-terminal.

Tir-416 din pp60v-src se fosforilează atāt in vitro cāt şi in vivo, īn timp ce pp60c-src se fosforilează numai in vitro iar Tir-527 numai in vivo. Īnlocuirea Tir-416 cu Fen modifică activitatea kinazică a mutantei şi inhibă parţial formarea de focare īn agar. Se presupune că diminuarea fosforilării la Tir-527, pe de o parte, şi fosforilarea crescută la Tir- 416, pe de altă parte, creşte capacitatea transformantă a pp60v-src. (4, 5)

Kinaza c-src sau proteina c-src se activează cānd fibroblastele murine NIH 3T3 sunt tratate cu oxid nitric, cu S-Nitrozo-N-Acetil penicilamină (SNAP) sau cu Nitroprusid de Sodiu. Oxidul Nitric(NO) atacă hemoglobina şi N(2) O(3) anulează homocisteina abolind SNAP mediatoarea kinazei c-src. SNAP promotează autofosforilarea la tirozină, preferenţial la Tir-416. Se sugerează că, formarea NO/N(2) O(3) provoacă S-nitrozilarea, formarea punţii S-S -destabilizānd structura src pentru activarea autofosforilării Tir-416 trecānd pe reglarea Tir-527 (6).

In vivo s-a testat acţiunea a trei forme diferite de v-src asupra dezvoltării celulelor creierului. v-src īn vectori retrovirali recombinaţi dar şi de v-src tip-sălbatic codifică markerul lac Z. Formele modificate arată deleţii īn domeniile v-src ce conţin SH2 şi SH3 (delta SH2 şi delta SH3) cu care s-au infectat progenitori neuronalidin tectum opticum al embrionilor de pui. Concentraţiile retrovirale au fost injectate īn embrionii de stadiul E3, iar sacrificarea s-a făcut īn stadiile E6 şi E9. S-au analizat migraţia şi diferenţierea progenitorilor marcaţi lac Z. Īn ceea ce priveşte controlul cu lac Z īn stadiul E6, sunt semnificativ crescute clonele cu v-src, dar neschimbate pentru delta SH2- şi mai reduse pentrudelta SH3.

Īn stadiul embrionar E9, clonele delta SH2 sunt semnificativ mai mari decāt controlul, sugerānd supravieţuirea crescută faţă de moartea programată a celulelor. Migraţia neuronală radială este afectată pentru clonele v-src şi delta SH3, pe cānd cea din clonele v-src şi delta SH2 este cuplată tangenţial de-a lungul fibrelor gliale. Dezvoltarea şi diferenţierea celulelor gliale radiale sunt afectate īn clonele v-src şi delta SH3. Īn concluzie, semnalizarea v-src ectopic altereză proliferarea, migrarea, suprvieţuirea şi diferenţierea neuronilor īn dezvoltare sugerānd că īn aceste procese sunt implicate căile de semnalizare src. Unele efecte ale v-src asupra celulelor nervoase reclamă domenii src omoloage (7).

Prin mutageneză directă s-a īnlocuit fiecare cisteină cu alanină, urmărindu-se efectul reziduurilor cisteinei din v-src asupra transformării celulare. Din zece asemenea reziduuri diseminate īn v-src, patru sunt importante īn domeniul kinazei şi anume cys 483, 487, 496 şi 498, fiind necesare īn stabilitatea proteinei şi īn transformarea celulară, īn timp ce cele din domeniul SH2 sunt dispensabile. O singură mutaţie īn cys498 duce la supresia activităţii kinazei şi la creşterea independenţei ancorajului sensibil la temperatură. Mutaţiile duble Cys 483/487 sau Cys 496/498 duc la transformarea celulelor sensibile la temperatură şi la stabilitatea protreinei src. Instabilitatea proteinei este crescută la mutaţia cvadruplă īn cisteină, care scade half-life src la Ľ comparativ cu   tipul-sălbatic. De asemenea, ambele kinaze devin rezistente in vitro prin inactivarea cu herbimycin A, care inactivează direct v-src, īn plus la efectul său pe HSP90. Se sugerează astfel că, cisteinele din v-src sunt critice pentru stabilitatea proteinei, pentru transformarea celulară şi pentru inactivarea in vitro de către herbimycin A (8).

Pentru īnţelegerea transducţiei semnalelor se folosesc molecule mici care ţintesc kinazele. Recent s-a descopreit inhibitorul PP-1 care inhibă selectiv TK din familia src. Un singur reziduu care corespunde la Ile-338 din familia TK-src controlează abilitatea PP-1 de a inhiba protein-kinaza. Schimbarea lui Ile-338 din v-src cu un reziduu mai mare cum sunt metionina şi fenilalanina determină o scădere a potenţialului inhibitor al PP-1. Mutaţia cu alanină sau glicină creşte īnsă potenţialul lui PP-1.

Alte kinaze cum sunt c-Abl şi MAP-kinaza p38, care nu aparţin familiei src sunt moderat inhibate de PP-1. Prin urmare, mutageneza locurilor de cuplare ATP īn kinazele tirozinice şi ser/thr explică de ce PP-1 este inhibitor specific al tirozinkinazelor familiei src (9).

Celulele tumorale desmoplazice de talie mică şi de formă rotundă (DSRCT) prezente īn cancerul uman malign se asociază cu translocaţia t(11; 22) specifică,īn care proteina EWS de 265 aminoacizifuzionează īn partea ei terminală cu un domeniu DNA al genei WT1 supresoare de tumori. Proteina prezintă cāteva domenii SH3 de interacţiune care cuplează cu secvenţe DNA WT1. S-a constatat că EWS/WT1 se poate asocia cu domeniul SH3 al cātorva proteine inclusiv v-src. Expresia ectopică a v-src fosforilează EWS/WT1 in vivo şi, de asemenea, amplifică abilitatea transactivării domeniului amino-terminal EWS. Alterarea structurală a domeniului SH2 sau SH3 a v-src produce mutante care nu pot interacţiona cu EWS/WT1 şi nici creşte proprietatea transcripţională a EWS. De aici, posibilitatea ca uneleproprietăţi transcripţionale alew EWS/WT1 pot fi reglate pe o cale de semnalizare citoplasmatică (10).

Gena c-src din celulele umane, omoloagă cu secvenţe din oncogena v-src a RSV joacă un rol important īn progresia cātorva tipuri de cancer uman , fără a suferi schimbări. Recent,s-a constatat totuşi, că trunchierea codonului 531 al genei c-src este prezentă la 12 % din cancerele avansate de colon. Analiza genei de la numeroşi pacienţi japonezi şi caucazieni cu cancer colorectal metastazat īn ficat, nu relevă alterări īn codoanele specifice 531 ale c-src, neavānd astfel un rol semnificativ īn progresia malignă a acestor neoplasme (11).

 

 

Src şi stat

 

Proteina Src foloseşte numeroase proteine īn procesele transmiterii semnalului şi īn transcriere. Proteina Stat-3 este activată īn fibroblastele NIH transformate de v-src, sugerānd un potenţial rol īn creşterea aberantă a celulelor. Stat-3 este fosforilată pe tirozina 705 reclamată pentru formarea dimerului, iar fosforilarea adiţională a serinei 727, pentru activitatea transcripţională a Stat-1 şi Stat-3.

Gena c-src detrmină activitatea de cuplare la DNA a mutantelor Stat-3 alfa şi beta şi a altor trei mutante Stat-3 din care serina 727 este īnlocuită cu alanina (Stat 3 alfa S-727A), iar moleculele delta 43 şi delta 55 sunt truncheate la C-terminal. Īn celulele cotransfectate cu
c-src se constată o creştere generată de Stat-3 fosorilată la tirozina 705. Transcrierea din gena reporter macroglobuluina alfa-2 este activată īn prezenţa c-src de către Stat-3-alfa S727A, cu aceeaşi, magnitudine cu cea a Stat-3 alfa şi beta. Se sugerează că serina727 conţine un loc consens de recunoaştere a MAP-kinazei şi este unica serină Stat-3 fosforilată īn celulele tratate cu EGF, dar nu este necesară pentru activarea transcripţională comparabil cu Stat-3 alfasau beta cānd este activată de c-src īn celulele COS-1 (12).

Etk (Bmx), un membru al familiei Btk de TK mediază transformarea celulară conjugānd activitatea src la Stat-3. Etk se exprimă īntr-o varietate de celule hematopoietice, epiteliale şi endoteliale. Coexpresia v-src şi Etk duce la transfosforilare pe tirozina 566 a Etk şi ulterior la autofosforilare, ceea ce se corelează cu creşterea substanţială a activităţii kinazei Etk. In vivo, Stat-3 este activat de Etk şi se asociază cu aceasta. Inactivarea dominant negativă a Etk, nu numai că blochează fosforilarea tirozinei indusă de v-src şi activarea Stat-3, dar reduce puternic şi activitatea transformantă a v-src. Astfel, Etk este un mediator critic al transformării celulelor de către src dar şi de activare a Stat-3.

Expresia Etk īn linia de hepatom uman (Hep 3B) duce la creşterea semnificativă a abilităţii sale transformante, efect abrogat īnsă de inhibiţia dominant negativă a Stat-3. Se sugerează, astfel, că Etk implică src īn activarea Stat-3. Reiese că, asocierea Src-Etk-Stat-3, reprezintă o cale importantă īn transformarea celulară(13).

Din familia kinazelor src, LCK poate induce fosforilarea Stat-3 şi activitatea de cuplare la DNA. Activarea constitutivă a kinazei LCK duce la transformare, iar, pe de altă parte, activarea constitutivă a căii Stat (factori de transcriere) este, de asemenea, implicată īn transormare. Cānd LCK şi Stat-3 se coexprimă, cel din urmă aratăfosforilare ampălificată a tirozinei şi activitate de cuplare la DNA. Activarea Stat-3 de către LCK exogen poate fi atenuată de inhibitorul PP1 specific pentru LCK. Celulele mamaliene care exprimă constitutiv activitate LCK au totdeauna activat şi Stat-3. Pin urmare, asemenea lui v-src, LCK poate activa direct Stat-3 care contribuie la procesul transformării (14).

O altă cale de transmitere a semnalului este PK-D. Stresul oxidativ iniţiat de adausul H(2) O(2) īn celulele dormante 3T3 activează PK-D īn funcţie de doză şi timp, fapt demonstrat de măsurarea prin autofosforilare şi fosforilare a substratului exogen syntid -2. Stresul oxidativ activează de asemenea PK-D transfectată īn celulele COS-7, dar nu forma PK-D mutantă deficientă īn kinază sau mutanta PK-D cu activare critică a reziduului serină 744 şi 748. Genistein sau inhibitorii specifici src-PP1 şi PP2.- inhibă cu 45% activitatea PK-D mediată de H(2) O(2), sugerānd că src contribuie la această cale de semnalizare.

Inhibitorul specific fosfolipazei C blochează parţial activarea PK-D mediată de H(2) O(2), dar nu activarea mediată de PD-B. Dimpotrivă, inhibitorii PK-C blochează activarea PK-D mediată de H(2) O(2) sau de PD-B sugerānd că, īn timp ce src mediază o parte a efectelor sale via activării fosfolipazei C, PK-C activează mai proximal ca un activator amonte al PK-D. Stresul oxidativ activează astfel PK-D prin iniţierea căilor distincte dependente şi independente de src (15).

 

Src şi proteina cas

 

Proteina p130 (Cas) este o moleculă adaptor ce devine tirozin-fosforilată īn transformarea indusă de v-src sau v-crk şi de cāţiva stimuli fiziologici printre care ataşarea celulelor la fibronectină. S-au generat şoareci fără cas, demonstrāndu-se faptul că proteina cas funcţionează ca o moleculă care asamblează filamentele de actină. Fibroblastele deficiente īn cas arată defecte semnificative īn mobilitate, după rănirea mecanică şi īn migrarea lor către fibronectină. Pe suport de fibronectină, celulele deficiente īn cas relevă o semnificativă īntārziere īn diseminare, comparativ cu cele īn care cas s-a reexprimat. Cas funcţionează astfel ca o moleculă care promotează mişcarea, migraţia şi diseminarea celulei, sugerānd că ar putea fi implicată īn diferite procese fiziologice şi patologice printre care vindecarea rănilor, chemotaxisul şi invazia tumorală (16).

Substratul src p130(cas) este o proteină trunchiată care conţine un domeniu SH3, un domeniu substrat cu multiple locuri de cuplare consens SH2 şi o regiune de cuplare a src. S-a urmărit dacă proteina cas joacă un rol via v-src īn activarea transcripţională a genelor imediat timpurii. Coexpresia v-src şi cas duce la o creştere de trei ori a transcrierii dependentă de SRE (serum respons element) dincolo de nivelul indus exclusiv de v-src.

Mutanta cas lipsită de regiunea de cuplare la src nu potenţează răspunsul EGF sugerānd că, proteina cas amplifică semnalizarea EGF prin cuplarea la src a celuleleor endgene sau prin alt membru al familiei src. Astfel, cas este implicată ca mediator al acativităţii transcripţionale indusă de src (17).

Īn celulele mamaliene transformate de oncoproteinele v-src şi v-crk, substratul p130 cas asociat cu crk este o proteină trunchiatăcu conţinut crescut īn fosfotirozină. Proteina cas este implicată şi īn controlul celulelor normale prin intervenţia ei īn transducţia semnalelor mediată de integrine şi prin organizarea citoscheletului cu actină la locurile de adeziune celulară.

La identificarea domeniilor src (SH3) din proteinele ortoloage de şoareci (nefrocistină) s-au folosit doi hibrizi de drojdii care utilizează regiunea C-terminal a cas cu o proteină umană care prin pierderea funcţiei duce la nefropatii juvenile familiale, o afecţiune chistică renală. Din clonele cDNA s-au dedus secvenţe putative de nefrocistină de lungime deplină de laşoareci şi parţial de la canine. Nefrocistina şi cas pot interacţiona īn celulele mamaliene, ambele fiind localizate īn sau lāngă locurile de contact intercelular, īn celulele epiteliale polarizate din rinichii cāinilor Madin-Darby. Aceste proteine au funcţii similare īn polarizerea celulelor epiteliale. Īn concluzie, proteina crk asociată cu substratul p130 cas intercţionează cu nefrocistina fiind localizată la contactul celulă-celulă şi polarizānd celulele epiteliale (18).

Expresia ectopică a src-cas este inhibată de terminus- COOH cas, dar nu are efect asupra transormării celulare. Īn celulele transformate de src, cas este intens tirozin-fosforilată, iar variantele genetice ale src deficitare īn cuplarea la cas nu pot media transformarea. Expresia domeniului de cuplare carboxi-terminal al cas īn fibroblastele Rat-1 cu alele v-src sensibile la temperatură, inhibă formarea complexului src-cas ca şi fosforilarea tirozinei cas. Totuşi, expresia acestei proeine nu are efect asupra transformării morfologice, rearanjării actinei mediată de src, sau asupra creşterii fibroblastelor la temperatura src permisivă, independent de ancoraj. Atfel, abilitatea src activată de a media transformarea celulelor este independentă īn deosebi de fosforilarea cas-endogen şi/sau īn asociere cu cas, sau alternativ terminusul carboxil cas putānd fi substituit īn procesul transformării de către src (19).

 

Src şi relaţiile celulă-celulă

 

Fibroblastele transformate cu v-src au nivele semnificativ reduse de comunicare intercelulară mediată de joncţiunea gap, ceea ce se asociază cu fosforilarea tirozinei din proteina Conexin 43 (Cx43) din joncţiune, asociere mediată de domeniileSH2 şi SH3 ale pp60v-src,kinaza activă care fosforilează Cx43 in vitro. Cx43 este un substrat endogen al pp60v-src īn fibroblastele trnsformate de această proteină. Colocalizarea confocală demonstrează că pp60v-src şi Cx43 sunt colocalizate parţial īn regiunea plasmalemei. Coprecipitarea lor īn fibroblastele transformate de v-src arată că cele două proteine sunt asociate formānd un complex stabil. Pp60v-src ar putea fosforila chiar Cx43 co-precipitānd īntr-un complex   kinază, iar locurile fosforilării tirozinei sunt aceleaşi cu ale fosforilării pp60v-src. S-a demonstrat in vivo că Cx43 este un substrat direct al fibroblastelor transformate de v-src. Abilitatea pp60v-src de a altera comunicarea intercelulară mediată de joncţiunea gap poate servi ca mecanism prin care proteina iniţiază şi/sau menţine aspecte ale transformării celulare (20).

Supresia comunicării intercelulare la nivelul joncţiunii gap de către variate PK, factori de creştere sau oncogene, se corelează radical cu amplificarea mitogenezei. Oncoproteina v-src este o cauză acută a īnchiderii canalelor joncţiunilor gap. Tyr 265 din COOH-terminal al Cx43 este implicată ca ţintă potenţială a v-src, deşi acţiunea acesteia este, de asemenea, asociată cu schimbări īn fosforilarea serinei. Trunchierea domeniului COOH-terminal duce la pierderea aproape completă a răspunsului proteinei Cx43 la v-src, proces restaurat prin coexpresia independentă de COOH-terminal a polipeptidului. Se sugerează un mecanism similar cu cel propus pentru bariera pH a Cx43, ca şi cu inactivarea canalului potasiului. S-a constatat că v-src mediază reacţia Cx43, dar nu reclamă locul tirozinei, depinzānd totuşi de prezenţa a doi potenţiali dimeri de cuplare SH3 şi de locurile de fosforilare a MAP-kinazei activată de mitogen.

Mutageneze īn celule normale din rinichi de şobolan (NRK) implică MAP-kinaze īn răspunsul barieră la v-src, īn timp ce cuplarea stabilă a v-src la Cx43 (mediată īn parte de domeniul SH3) nu se corelează cu abilitatea sa de a media īnchiderea canalului potasiului. Se sugerează o legătură comună īn īnchiderea joncţiunii de către v-src şi alţi mitogeni printre care EGF şi acidul lipofosfatidic (LPA) (21).

Transformarea celulelor epiteliale MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) cu v-src induce expresia MT1-MMP (metaloproteinaza 1 matricială-tip membranar) şi creşterea metastazantă a celulelor la şoarecii nuzi. Īn scopul analizei genelor asociate cu fenotipul invaziv al celulelor MDCK v-src, s-a urmărit mRNA-ul celulelor transformate şi al celor de control. Clona 12' a cărei expresie este clar suprareglată īn celulele transformate, codifică o proteină omoloagă īn proporţie de 81% cu TIMP-1. Expresia MT1-MMP este amplificată, īn timp ce celelalte metaloproteinaze matriciale nu s-au detectat sau au fost represate īn celulele transformate. Proteoliza gelatinei tip I din celulele MDCK v-src este inhibată de TIMP-2 şi nu de TIMP-1. Celulele MDCK stabile, transfectate cu gena MT1-MMP degradează gelatina care este selectiv inhibată de TIMP-2. Se sugerează că MT1-MMP a cărei expresie este indusă īn celulele MDCK v-src, degradează matricea extracelulară prin ea īnsăşi mai curānd decāt prin activarea progelatinazei A care, īn replică, contribuie la metastazarea celulelor transformate (22).

La 54 cazuri de carcinom mamar cu infiltrare ductală s-a studiat imunolocalizareafodrinei, E-caderinei şi beta-catetinei, īn ideia stabilirii relaţiei dinamice dintre componentele complexului de adeziune. Īn tumorile de grad scăzut, colorarea apare similară pentru primele două proteine şi anume pe plasmalemă, iar īn cazul beta-catetinei colorarea este mai redusă pe plasmalemă comparativ cu epiteliul ductal normal. Tumorile de grad īnalt arată localizare masivă a fodrinei atāt pe membrană cāt şi īn citoplasmă, īn timp ce E-caderina arată numai fragmente sau absenţa totală din membrană; numai ocazional apare slab prezentă īn citoplasmă. Beta-catetina este, de asemenea, fragmentată pe membrană dar, īn schimb se acumulează īn citoplasmă şi numai rareori īn nucleu. După 15 minute de activare cu src, beta-catetina īn linia MDCK transformată de v-src īncepe săse deterioreze la nivelul membranei, localizandu-se īn citoplasmă, īn timp ce fedrina şi E-caderina rămān neschimbate. După 30-45 minute de activare cu src, celulele īşi pierd forma cuboidă şi contactele dintre ele; fodrina rămāne pe membrană iar E-caderina şi beta-caterina apar fragmentate. După 60 minute fodrina se detectează numai īn citoplasmă iar E-caderina şi beta-catetina sunt parţial īn citoplasmă şi fragmental īn membrană. Uneori, beta-catetina se detectează īn nucleu. Astfel, atăt in vivo cāt şi in vitro disrupţia citoskeletului format din E-caderină/beta-catetină/fodrină este concomitent legată de pierderea adezivităţii intercelulare şi de schimbarea formei celulei din feniotip epitelial īn fenotip fibroblastoid.

Localizarea pe membrană a E-caderinei este īnsoţită de coloraţia pozitivă pentru expresia estrogenului şi progesteronului, īn timp ce pierderea acesteia din membrană şi acumularea fodrinei īn citoplasmă sunt mai pronunţate īn carcinomul de grad īnalt unde expresia p53 este pozitivă (23).

 

 

Src, NF-kB/Rel şi ciclinele D1A

 

Gena ciclinei D1 se hiperexprimă īn tumorile mamare īn care codifică o subunitatereglatoare a kinazelor dependente de ciclină care fosforilează proteina Rb. Activitatea pp60 (c-src) este radical crescută īn tumorile mamare. Această proteină induce nivele ale ciclinei D1 a cărei activitate īn celulele MCF7 o amplifică pānă la 48 ori. Activitatea kinazeiasociată ciclinei D1 şi nivelul proteineisunt crescute īn tumorile mamare ale şoarecilortransgenici purtători de virus - pp60 (v-src 527F). Inducţia optimă a ciclinei D1 de către pp60 (v-src) implică kinaza care reglează semnalele extracelulare, respectiv p38 şi membrii kinazei c-jun N-terminal ai familiei PK activate de mitogeni.

Activarea promotorului ciclinei D1 de către pp60 (v-src) implică un loc cAMP CREB (response element binding protein)/ATF-2 (activator - factor de transcriere 2). Mutante dominant negative ale CREB şi ATF-2 dar nu ale c-jun inhibă inducţia ciclinei D1 de către pp60 (v-src). Inducţia lui CREB de către pp60(v-src) este blocată de inhibitorul p38 (SB203580) sau de mutaţia CREB la serina 133.

Inducţia ATF-2 de către pp60 (v-src) este abolită de c-jun kinza, inhibitor JNK-interacting protein-1 sau demutanta ATF-2 la Thr69 şi Thr71 CREB şi ATF-2 care cuplează la elementul de răspuns comun - pp60 (v-src) - sunt activate transcripţional de PK la rāndul lor activate distinct de mitogen. Inducţia ciclinei D1 de către pp60 (v-src) poate contribui la tumorogeneza mamară prin fosforilarea şi inactivarea proteinei Rb (24).

Tratarea celulelor NIH3T3 cu etopsid (VP16), un inhibitor al DNA topoizomerazei II folosit ca anticancerigen, duce la stoparea ciclului celular īn fazele G2/M, īn timp ce tratarea celulelor transformate de v-src sau v-raf duce la blocarea acestora īn faza S, blocare cuplată cu sistarea activităţii kinazei dependente de ciclina A, ceea ce nu se poate explica prin schimbările īn nivelul ciclinelor A, CDK2, p27 sau p21. Mai curānd, acest proces este asociat cu reducerea, īn funcţie de timp, a proteinei CDK2 complexată cu ciclina A1, după tratarea cu VP16. Scăderea nivelului proteinei CDK2 asociată cu ciclina A este legată de creşterea CDK2 īn imunocomplexele cu ciclina E, ceea ce sugerează că CDK2 s-ar putea redistribui după tratarea cu VP16. Prin urmare, transformarea oncogenică cu v-src poate determina separarea proteinei CDK2, de ciclina A ca răspuns la acţiunea lui VP16, contribuind astfel la sistarea activităţii kinazei dependentă de ciclina A şi la oprirea selectivă īn faza S a celulelor transformate de v-src (25).

RelBeste un factor NF-kB/Rel cu activitate constitutivă de cuplare la DNA īn celulele limfoide. Acest factor este, de asemenea, constitutiv activ īn linia de fibroblate SR1 transformate de v-src. Īn celulele parentale 3Y1 (netransformate) v-src induce NF-kB. Activitatea lui Rel B, deşi mai puţin extinsă, se observă şi īn două linii adiţionale de fibroblaste transformate de v-src.

Degradarea IkappaB, p105 şi a altor membrii ai familiei IkB depinde de agenţi care inhibă activitatea proteosomilor. Tratarea celulelor SR1 cu inhibitori proteosomali aboleşte activitatea Rel B sugerānd că aceasta se asociază īn celule cu IkB şi că transformarea cu v-src activează proteoliza IkB. TNFalfa şi serul cresc nivelul proteinei RelB īn celulele 3Y1, proces blocat de inhibitorii proteosomali (26).

 

 

Src şi drs

 

Īntr-o linie de cancer uman s-a introdus un retrovirus recombinat amfotropic care conţinea gena drs subreglată, constatāndu-se că gena are abilitatea de a supresa creşterea celulelor, independentă de ancoraj, dar fără să afecteze proliferarea lor. Analiza mutantelor deletate ale genei relevă că regiunea C-terminal a domeniului transmembranar şi 3 ripituri consens din regiunea N-terminal sunt esenţiale pentru supresia creşterii independente de ancoraj. De asemena, s-a observat că īn celulele non-adezive T24 care exprimă gena drs īn condiţii de cultură, progresia din faza G1 īn faza S a ciclului celular şi expresia mRNA al ciclinei A sunt semnificativ supresate. Expresia ciclinelor D şi E şi fosforilarea proteinei Rb nu sunt afectate de expresia ectopică a acestei gene, sugerāndu-se că subreglarea ciclinei A independent de Rb este implicată pe calea genei drs īn supresia creşterii independente de ancoraj. (27)

Expresia mRNA drs este subreglată de oncogene retrovirale cum sunt v-src şi v-K-ras care au abilitatea de a supresa transformarea liniei F2408 de şobolan de către aceste două oncogene. S-a izolat un omolog uman al genei drs (h-drs) īn care expresia mRNA este marcat redusă īntr-o varietate de linii de cancer uman (cancer de colon, de vezică urinară, de ovar) sugerānd că subreglareaacestui mRNA drs se corelează cu apariţia cancerului. Īn majoritatea ţesuturilor canceroase s-a detectat expresia mRNA drs, deşi, īn adenocarcinomul de colon expresia lui este neīnsemnată. Nu s-a constatat deleţia sau rearanjarea genei drs īn ţesutul adenocarcinomatos. Īn schimb, mRNA drs este semnificativ exprimat īn adenomul de colon cu uşoare atipii, fiind subreglat īn adenocarcinomul cu atipii moderate şi īn carcinomul focal? Prin urmare, subreglarea mRNA drs este strāns corelată cu apariţia adenocarcinomului de colon, sugerānd că gena drs are o funcţie supresoare asupra tumorilor īn cancerele umane (28).

Src şi proteinele G

 

Deşi transformarea cu src a fibroblastelor NIH3T3 de şoarece este dependentă de Ras, mecanismele semnalizării prin care src induce transformarea malignă a celulelor epiteliale umane sunt īncă obscure. S-a analizat rolul lui Ras care activează aval de Src, īn semnalizarea intracelulară şi īn achiziţia potenţialului neoplayic deplin de către celulele epiteliale HAG/src3-1 ale vezicii biliare umane transformate de v-src prin infiltrarea lor cu un adenovirus vector defectiv īn replicare, care exprimă oncogena Ha-Ras dominant negativă-AdvCARasY57-.Īnalta eficienţă a transducţiei genei s-a demonstrat cu un vector adenoviral care conţinea insertul genei beta-gal (AdvCALacZ). Activitatea MAP-kinazei, eveniment major determinat aval de Ras este marcat inhibată după 7 zile de infecţie cu AdvCARasY57, ceea ce sugerează că inhibarea funcţiei ras de către acest adenovirus rămāne activă īn acest interval. AdvCARasY57 nu inhibă creşterea īn monostrat a celulelor HAG-1 transfectate cu Ha-ras activate, dar inhibă cu 30% celulele HAG/src3-1 comparativ cu celulele de control infectate cu AdvCALacZ. Inhibarea creşterii de către AdvCARasY57 este de două ori mai eficientă pe suprafaţa acoperită cu un polimer antiadeziv (poly2-hidroxietilmetacrilat) care permite creşterea independentă de ancoraj. Pe substrat de agar moale, creşterea este īnsă, cu 95% mai pronunţată.

Celulele HAG/src3-1 transfectate cu gena beta-gal produc tumori la şoareci nuzi la 4 săptămāni după implantare, īn timp ce celulele infectate cu AdvCARasY57 nu produc tumori īn acest interval. Se conclude că, funcţia lui Ras indusă de src este esenţială pentru creşterea celulelor in vitro, independentă de ancoraj, ca şi pentru tumorogeneza in vivo. De asemenea, activitatea mitogenică indusă de v-src nu este singura dependentă de calea MAP-kinazei. Īn plus, creşterea independentă de ancoraj se corelează cu creşterea tumorii in vivo, dar şi cu potenţialul metastazant. "Ţintirea" lui Ras ar putea folosi ca tratament al tumorilor umane cu TK src īnalt activate (29).

Pentru transformarea fibroblastelor de embrion de pui (CEF) de către v-src este necesară creşterea nivelului lui ras-GTP activ cuplat, de unde sugestia că alte căi independente de ras contribuie la transformare. Inhibarea simultană a semnalizării pe calea ras-MAP-kinazei şi a inhibitorului Pi3K-mTOR (fosfatidil inozitol-3-kinaza-LY294002 (2-[4-morfolinil-8-fenil-4H-1-benzopiren-4-om) blochează esenţial transformarea. Deci, transformarea celulelor CEF de către v-src este mediată pe două căi paralele: ras-MAPK şi Pi-3K-mTOR deşi nu este exclusă nici posibilitatea activării simultane a celorlalte căi (30).

Anhidraza carbonică II (CAII) catalizează hidratarea carbonică reversibilă a CO2 avānd rol cheie īn homeostazia acido-bazică la mamifere. Promotorul genei CAII pare activat īn celulele umane HeLa şi T47D, cānd plasmide cu CAII-luciferază sunt transfectate cu v-src. Īn cazul mutantelor src, CAII este slab activă. iar supresarea completă a activării ei seface prin introducerea īn celulele T47D a unei gene ras dominant negativă; īnsă, introducerea ei īn celulele HeLa nu induce supresie. Pe de altă parte, variate deleţii īn promotorul CAII relevă două regiuni esenţiale care răspund de activare. Īn concluzie, src poate modula īn unele celule umane, promotorul genei CAII prin exercitarea activităţii sale tirozinkinazice, iar cele două căi de semnalizare ras-dependentă şi ras-independentă acţionează īn funcţie de tipul celular (31).

Supraproducţia urokinazei-activator al plasminogenului (uAP)- şimetaloproteinazelor (MMP) se corelează semnificativ cu tumorogenicitatea şi metastazarea tumorilor umane şi experimentale. Supraproducţia uAP īn celulele tumorale este mediată de fosfoliupaza D (PLD) şi de mecanisme dependente de PKC. Oncogenele v-src şi v-ras induc activarea PLD dependentă de GTP-aza monomerică. Celulele NIH3T3 transformate de cele două oncogene hiperproduc uAP constitutiv, dar expresia mutantei dominant negativă Ra1A (S28N) blochează hiperproducţia. Oncogenele supraactivează MMP-2 şi MMP-9, deşi numai inducţia de către v-src se corelează cu nivelele proteinelorMMP detectate prin analiza Western blot. Mutanta S28N blochează creşterea nivelului celor două metaloproteinaze, ca şi supraproducţia indusă de v-src, dar activitatea acestora indusă de v-ras nu creşte. Mutanta blochează complet formarea tumorii indusă de v-src şi v-ras īn celulele NIH3T3 atunci cānd este injectată subcutan la şoareci singeneici. Prin urmare, Ra1A şi PLD se implică ca mediatori de semnale īn formarea tumorilor (32).

Fosfolipaza D (PLD) creşte ca răspuns la semnalele mitogenice. Deşi fenotipul transformat de v-src este dependent de Raf-1, activitatea enzimei indusă de v-src este independentă de Raf-1, ceeea ce sugerează că aceasta nu poate fi un activator al PLD. Totuşi, activitatea PLD īn celulele transformate de v-Raf este crescutăla nivele care depăşesc pe cele constatate īn celulele transformate de v-src. Este astfel descris un nou mecanism de activare a PLD de către v-Raf, mecanism independent de PK-C dar dependent de GTP-azele Ra1 şi Rho (33).

Oncoproteina v-src perturbă reglarea dinamică a citoscheletului şi reţeaua de adeziune printr-un mecanism īncă obscur. S-a urmărit efectul proteinei v-src dependentă de temperatură, asupra reglării p190 Rho GAP, o GTP-ază care activează o proteină GAP implicată īn disrupţia scheletului actinic organizat şi care vizează pierderea dependenţei fibrelor de actină indusă de v-src asupra inhibării activităţii lui rho?. S-a constatat astfel că, activarea v-src induce asocierea p190 tirozin-fosforilată cu p120 (rasGAP) şi stimulează pe cea din urmă asociată cu rhoGAP deşi ea īnsăşinu este o ţintă pentru fosforilarea de către v-src īn celulele embrionare de pui. Aceste procese reclamă activitatea catalitică a v-src şi sunt legate de pierderea fibrelor de actină īn timpul transformării morfologice, dar nu sunt legate de semnalizarea mitogenică. Aceste efecte sunt imediat reversibile deoarece procesarea lui v-src duce la disocierea complexului p190/p120 (rasGAP), la inactivareap120/rasGAP- asociată cu activitatea rhoGAP şi la reinducţia fibrelor speciale de actină.

Transfectarea tranzitorie a Val 14-rhoA, o proteină rho constitutiv activă insensibilă la rhoGAP, supresează pierderea fibrelor speciale de actină indusă de v-src, ca şi transformarea celulară. Īn premieră se arată că, o kinază src activă reclamă inactivarea fibrelor de actinămediată de rho pentru a induce efecte de dezorganizare a actinei. De asemenea, se consideră că p190 este un puternic efector, candidat la disrupţia citoscheletului indusă de v-src, mediată principalmente de antagonismul funcţiei celulare a lui rho (34).

Īn celulele mamaliene, organizarea actinei polimerizate este reglată de cāţiva membrii ai familiei rho printrecare rac, cdc42 şi rho care activează īn cascadă pentru a organiza citoscheletul actinei intracelulare. Proteinele rho sunt implicate īn formarea fibrelor de actină şi a plăcilor de adeziune a fibroblastelor. Īn timpul transformării celulelor mamaliene de către oncogene, citoscheletul este rearanjat iar fibrele se leagă cu plăcile de adeziune ce se dezintegrează.

S-a analizat funcţia proteinelor rho īn fibroblastele RR1022 de şobolani transformate de RSV, constatāndu-se că două mutante activate ale proteinei rho-G14V şi Q63L- şi o mutantă negativă -N1171- sunt stabil transfectate īn aceste celule. Liniile rezultate au fost analizate īn vederea stabilirii organizării actinei polimerizate şi a plăcilor de adeziune. Celulele care exprimă rho Q63L, dar nu rho tip-sălbatic, rho14V sau rho N1171 au morfologia alterată şi sunt comprimate comparativ cu celulele tip-sălbatic, iar plăcile de adeziune apar rearanjate. Se conclude că, proteina activă rho poate restaura īn celulele transformate, elementele citoscheletului de actină trcānd peste fosforilarea tirozin-kinazei indusă de pp60v-src (35).

Gt12 este un membru al subunităţii alfa a proteinelor G heterotrimerice din subfamilia G12 care stimulează activitatea c-jun N-terminal kinazei (JNK) prin proteinele ras, rac şi cdc42, mici proteine care cuplează GTP. S-a folosit expresia tranzitorie a mutantei Galfa12 (Galfa 12Q 229L) activată constitutiv īn celulele 293 (HEK) de rinichi de embrion uman, constatāndu-se că rho şi src sunt, de asemenea, implicate īn activarea indusă de mutantă īn JNK activare inhibată de rhoA(T19N) negativ dominantă şi de exoenzima botulinum C3 care inactivează specific rho. Īn plus, expresia lui rhoA(G14V) activată indică activitatea lui JNK īn celulele HEK. Activarea lui JNK stimulatăde Galfa12Q229L este blocată de inhibitorul specific al PTK(PP-2) şi CSK(C-terminal src kinază). De asemenea, Galfa12Q229L stimulează activitatea membrilor familiei kinazei src şi a JNK indusă de v-src. Activitatea JNK indusă de v-src este inhibată de rhoA (T19N) dominant negativă. Dimpotrivă, CSK nu inhibă activarea lui JNK de către rhoA(G14N) activată. Se sugerează că, rho şi familia de kinaze src sunt necesare pentru activarea JNK indusă de Galfa12 şi că src activează pe calea JNK amonte de activarea rho (36).

Terapie

 

Factorii supresori ai transformării de către oncogene virale sunt exprimaţi īn fibroblastele primare de embrioni de şobolani (REF). S-a preparat un subextract de cDNA folosind REF şi o linie normală de fibroblaste de şobolani- F2408-.

S-au izolat 30 diferite clone de cDNA a căror expresie mRNA apare marcat redusă īn celulele F2408 comparativ cu cele REF. Aceste clone au fost numite TRIF (transcript reduced in F2408). Iniţial s-a testat activitatea pe 3 gene TRIF care supresează procesul transformării: TRIF-1 (neuronatin), TRIF2 (heparin-binding-growth-associated molecule) şi TRIF3 (lumican). TRIF3 inhibă formarea focarului indus de celulele F2408 activate de H-ras. Formarea coloniilor induse de v-K-ras sau de v-srcīn agar moale supresează, de asemenea, clonele F2408 care exprimă stabil limican exogen fără a disturba proliferarea celulelor. Deci, lumican are abilitatea de a supresa transformarea de către v-src şi v-K-ras (37).

 

 

 

Cuprins

© University of Bucharest 2002. All rights reserved.

No part of this text may be reproduced in any form without written permission of the University of Bucharest, except for short quotations with the indication of the website address and the web page.

Comments to: Dumitru Mişcalencu, Lăcrămioara Ivanciu, Florica Mailat, Cristina Bordea
Last update: September 2002
Text editor: Monica CIUCIU