Dumitru Mişcalencu, Lăcrămioara Ivanciu, Florica Mailat, Cristina Bordea, Oncogene virale

 

GENA ABL

Leucemia mielocitară cronică (CML), un tip specific de cancer uman, boală mieloproliferativă clonală se caracterizează prin acumularea celulelor mieloide şi a precursorilor lor. În stadiul avansat al bolii - criza blastică -, acestea sunt blocate şi nu se mai diferenţiază, şi în consecinţă boala fiind invariabil fatală. CML este caracterizată de o translocaţie specifică t(9; 22) (q34; q11) a genei c-abl de pe braţul lung al cromosomului 9 la punctul de rupere din regiunea bcr de pe cromosomul 22. Translocaţia duce la formarea unei oncogene himerice de fuziune - bcr-abl - care produce alternativ oncoproteinele de fuziune de 210kD şi respectiv de 190kD, proteinkinaze anormale. Această translocaţie este prezentă la 95% pacienţi cu CML şi la un subset semnificativ de leucemii acute în special limfoide. Deci, această rearanjare cromosomială conduce la fuziunea genelor bcr cu abl, care codifică mRNA bcr-abl specific leucemiei în care apare cromosomul Ph+(1,2).

Gena ABL a fost descoperită de Abelson în virusul Ab-MuLV care produce la şoareci limfomul celulelor pre-B şi plasmocitomă. În acest caz boala este declanşată de gena v-abl (care se considera gena c-abl transdusă în genomul viral) în asociere cu un rest din gena gag. Gena hibrid gag-abl codifică o proteină de 136,6kD, fiind o tirozin kinază specifică cu capacitatea de a se autofosforila, dar şi de a fosforila câteva proteine celulare (3).

Pentru determinarea secvenţelor codificante ale protooncogenelor c-abl de la om şi şoareci s-au investigat clone de DNA celular obţinute din liniile celulare leucemice T umane, CCRF-CEM şi din linia celulară pre-B de şoareci 70Z/3. Secvenţierea DNA la om evidenţiază un ORF-DNA care codifică 906 aminoacizi iar la şoarece codifică 896 aminoacizi. Secvenţierea relevă că v-abl este o formă trunchiată a c-abl murin. Secvenţele nucleotide v-abl sunt identice cu cele ale lui c-abl murin, iar secvenţele de la om arată numai cinci schimbări în aminoacizii lui v-abl. Cele mai multe secvenţe care s-au pierdut în procesul generării lui v-abl sunt cele de la capătul C-terminal(4).

A-MuLV este un retrovirus transformant acut care vizează atât in vivo cât şi in vitro linia B timpurie. Proteina sa transformantă, v-Abl, este o tirozin kinază înrudită cu   v-src şi conţine un domeniu C-terminal extins. Mutante în porţiunea C-terminal a moleculei, blochează transformarea în stadiul pre-B, fără însă a afecta transformarea fibroblastelor.

Proteina v-Abl trunchiată la C-terminal (p90) tip-sălbatic are abilitatea de a transforma celulele de şoarece p53 (-/-). Absenţa p53 creşte susceptibilitatea celulelor măduvei osoase de a fi transformate de v-Abl. Şoarecii cu deficienţe p53 au tumori (limfoame pre-B) care apartimpuriu iar timpul de supravieţuire scade după infectarea cu A-MuLV.Astfel, căile dependente de p53 inhibă transformarea de către v-Abl dar nu intervin în transformarea potenţială a pre-B. v-Abl (p90) transformă însă foarte eficient limfocitelepre-Bla şoarecii lipsiţi de p53, de unde concluzia că C-terminal al v-Abl nu determină tropism pentru celulele pre-B (5).

Transformarea celulelor pre-B de către Ab-MuLV implică un echilibru între semnalele pozitive care stimulează creşterea indusă de oncoproteina v-Abl şi reglarea negativă a genelor celulare. Aceste procese apar prin selecţia clonală din timpul transformării mediate in vitro şi in vivo de Ab-MuLV. Aproximativ 50% din celulele pre-B transformate de Ab-MuLV exprimă forme mutante ale p53 sugerând că aceasta poate juca un rol important în procesul transformării.

Pentru a testa rolul p53 în transformarea directă a celulelor pre-B, s-a urmărit răspunsul şoarecilor Trp 53 (-/-) la acţiunea Ab-MuLV. Absenţa p53 scurtează latenţa inducţiei bolii Abelson., dar nu afectează celulele susceptibile la transformarea indusă de Ab-MuLV. Totuşi, transformatele primare derivate din multe animale care depăşesc criza apoptotică, caracterizează tranziţia din transformatul primar în linia malignă deplină (6).

Deci, geneza tumorală este un proces în multe trepte, care implică activarea oncogenelor şi inactivarea genelor supresoare de tumori. Este cunoscută activitatea transformantă a oncogenei v-abl din A-MuLV în linii imortalizate dar efectele lui v-abl asupra fibroblastelor primare sunt încă neclare. V-Abl opreşte ciclul celular în fibroblastele primare de embrioni de şoarece (MEF). MEF p53 (-/-) sau p19 Arf(-/-) sunt rezistente la activitatea transformantă a proteinei v-Abl şi la oprirea ciclului celular. Celulele MEF tip-sălbatic sunt rezistente la activitatea transformantă a v-Abl, iar celulele MEF p53(-/-) sau pArf (-/-) sunt susceptibile. Prin urmare, pierderea funcţiei p19 Arf şi p53 joacă un rol important în timpul transformării celulelor primare de către v-Abl (7).

Proteina TK c-abl este implicată în calea semnalizării, în trnscriere, repararea DNA, apoptoză şi în câteva alte proprietăţi biologice vitale, esenţiale pentru proliferarea şi diferenţierea celulelor. Interacţiunea c-abl cu DNA este importantă pentru unele din aceste funcţii. Locul de cuplare consens este 5'-AA/CAACAAA/C. Tripletul central cel mai înalt conservat-AAC- reprezintă elementul crucial în secvenţele cuplate ale proteinei c-abl. Interacţiunea implică contactul cu un dublu helix cu canelare minoră. Proteina potenţează activitatea de relaxare DNA de către topoizomeraza I. Deci, interacţiunea proteinei abl cu DNA este atât secvenţial-specifică, cât şi dependentă de structură (8,9).

Kinaza abl codificată de genaabl inhibă apoptoza, fără a afecta proliferarea celulelor. Analize imunohistochimice cu anticorp policlonal anti-oncoproteina c-Abl/Bcr-Abl indică imunoreactivitate slabă pentru abl în multe ţesuturi adulte şi moderată (în citoplasmă şi nucleu) în cartilaj, adipocite şi epiteliile ciliate.

În ţesuturile fetale, p-abl se exprimă în toate tipurile de muşchi şi ocazional, în celulele endoteliale. Cea mai intensă colorare s-a constatat în locurile de osificare encondrală şi în stroma cordonului ombilical.

Imunoreactivitate negativă s-a observat în epidermă, epiteliul scvamos, ganglionii limfatici, tonsila, splină, hepatocite şi glanda adrenală. Tumorile reactive pentru abl sunt condrosarcomul, liposarcomul şi adenocarcinomul gastric difuz. Se sugerează ca p-abl nu este numai inhibitor al apoptozei, ci are, de asemenea, un rol în maturarea şi diferenţiarea diferitelor tipuri de ţesuturi conjunctive , în creşterea tumorilor şi în angiogeneză (10).

S-a demonstrat că c-abl este exprimat în testiculele de şoarece şi şobolan predominând în spermatociteleale meiozei I. C-Abl interacţionează direct cu cromosomii meiotici şi în contrast cu şoarecii tip-sălabatic testiculele celor fără abl (-/-), arată defecţiuni în spermatogeneză. Pentru prima oară se demonstrează că c-ablintervine funcţional în meioză (11).

Protooncogenaabl-1, codifică o TK citoplasmatică şi nucleară, care este implicată şi în procesele dediviziune, adeziune celulară şi răspuns la stres. Alterările  abl-1 de către rearanjările cromosomiale sau transducţia virală pot duce la transformări maligne. Activitatea proteinei c-abl este reglată negativ de domeniul său SH3 printr-un mecanism încă necunoscut, alterarea acestui domeniu determinândtransformarea p-Abl-1 într-o oncoproteină. Mutaţiile sunt direcţionate în cele trei domenii activatoare a c-Abl, iar mutaţiile în "linker" induc o schimbare conformaţională a moleculei şi cresc cuplarea domeniului SH3 la liganzii peptidici. De asemenea, mutaţii individule a două reziduuri care şarjează SH3 şi domeniul catalitic (SH2-CD-linker) activează c-abl. Reglatorii c-abl au efecte opuse asupra activităţii protooncogenei în funcţie de abilitatea lor de a favoriza sau disturba această interacţiune intramoleculară (12).

Activitatea PTK c-abl este strâns reglată în celulele vertebratelor, câteva mutante putând activa c-abl şi astfel convertind-o într-o oncogenă. În formele virale ale abl (v-abl) secvenţele gag sunt fuzionate la porţiunile abl rezultând o deleţie a secvenţei N-terminal faţă de c-abl. Mutaţii în domeniul SH2 sau în locul fosforilării reduc dramatic abilitatea abl de a conferii fenotipul cu creştere stopată şi de a fosforila proteine endogene, sugerând un rol fundamental al acestei structuri. Domeniul mutant de deleţie SH3-1 este la fel de activ ca
c-abl din drojdii, indicând faptul că nu există o reglare intrinsecă a c-abl apărută via domeniul SH3 şi sugerând că efectul acestui domeniu observat în celulele de origine ale vertebratelor este mediat de un factor(13).

Carboxil-terminal al proteinei v-Abl poate creşte funcţia domeniul SH2. Ab-MuLV transformă celulele NIH 3T3 şi pre-B via expresiei v-Abl TK. Deşi activitatea enzimatică a acestei molecule este indispensabilă pentru transformare, şi alte regiuni ale proteinei sunt reclamate pentru acest răspuns. Printre acestea este domeniul SH2 implicat în interacţiunea proteină-proteină dependentă de fosfotirozină şi de terminusul lung carboxil care joacă un rol important în transformarea celulelor hematopoietice.

Semnale importante sunt trimise din fiecare din aceaste regiuni şi transformarea este dirijată de acţiunea concertată a acestor diferite părţi ale proteinei. S-a comparat abilitatea domeniului v-src SH2 de a substitui pe cel al v-Abl-proteină de lungime deplină p120 v-Abl şi proteina p70 v-Abl, o proteină care nu are terminusul COOH caracteristic membrilor familiei Abelson. Astfel, tulpinile Ab-MuLV care exprimă p70/S2 nu transformă celulele NIH 3T3 şi arată o capacitate considerabil redusă de a media evenimentele de semnalizare asociate cucalea proteinei MAP-kinazei activată de mitogen dependent de Ras. Tulpina Ab-MuLV care exprimă p120/S2, nu se deosebeştesub aceste aspecte de p120. Mutantele adiţionale arată că, cel puţin 162 aminoacizi ai terminusului COOH sunt suficienţi pentru a restaura transformarea. Deci, un domeniu SH2 cu specificitate de substratv-Abl este reclamat pentru transformarea celulelor NIH3T3, în absenţa terminusului COOH şi sugerează că, cooperarea între terminusul carboxil şi domeniul SH2 facilitează transmiterea semnalelor transformante via căii MAP-kinazei. (14).

Transformarea fibroblastelor 3T3 de către tirozinkinaza v-Abl înlocuieşte semnalele mitogenice şi de adeziune reclamate în mod normal de progresia ciclului celular. Prin transformarea liniei 3T3 de către v-Abl s-a stabilit că oncogena induce sinteza E2F reclamată pentru ciclul celular şi a mRNA pentru ciclina D1 şi D2, iar inhibitorul CDK p27 scade în urma acţiunii v-Abl (15).

Forma oncogenică a TK c-abl induce transcrierea genei c-myc a cărei funcţie este necesară, într-o anumită măsură, în programul de transformare cu v-abl. Locul E2F din promotorul c-myc este un element de răspuns v-Abl, iar v-Abl induce c-myc prin iniţierea cascadei fosforilării care în final activează proteinele ce cuplează locusul E2F. Urmărindu-se calea semnalizării dintre TK v-abl şi proteinele E2F activate, s-a demonstrat că ras (GTP-ază) şi kinaza Raf 1 serin/treonină sunt necesare în această cale. Pe de altă parte, în contrast cu alte aspecte ale semnalizării ale v-abl, inducţia transcrierii c-myc este independentă de Rac (GTP-ază). De asemenea, necesarul de kinaze activate, dependente de cicline (cdk), inducţia c-myc este însoţită de activarea cdk2 şi cdk4. Inducţia c-myc dependentă de v-abl este însoţită de hiperexpresia pRb, p107 şi p130. Se apreciază că acestă cale de semnalizare v-Abl induce transcrierea c-myc (16).

Oncogenele leucemogenice precum PTK (Protein Tirozin Kinaze) disturbă reglarea normală a supravieţuirii, proliferării şi diferenţierii progenitorilor hematopoietici. În absenţa citokinelor, progenitorii celulari mor prin apoptoză. PTK Abl mediază supresia răspunsului apoptotic ducând la supravieţuire aberantă .

S-a folosit linia de mastocite murine dependente de IL3 (factori de crestere hematopoietic) care exprimă o formă sensibilă la temperatură a PTK v-abl, activă la temperatura permisivă de 320 C şi inactivă la 390C. La temperatură permisivă, celulele sunt rezistente la apoptoza indusă prin absenţa IL-3 şi adiţia drogurilor citotoxice. Se arată că v-Abl se asociază cu activarea fosfatidil-inozitol 3-kinazei pe care o stimulează, activare care duce la amplificarea nivelului celular al masei de mesageri secunzi PI-3,4,5-trifosfat. Activarea PI3-K duce la activitatea amplificată a PKB şi la nivele crescute ale proteinei antiapoptotice Bcl-x (L).

Transfectarea celulelor cu PKB dominant negativă reduce activitatea PKB stimulată de Abl şi efectul de supravieţuire conferit de activarea acestei oncogene. Astfel, PI3-K şi PKB sunt reclamate pentru efectele aniapoptotice ale PTK Abl. (17)

 

 

Un nou membru al familiei DOK care leagă şi modelează semnalizarea Abl

 

Proteina P62 DOK numită şi DOK-L conţine structuri ale moleculei de semnalizare intracelulară, respectiv, un domeniu N-terminal PH (omolog cu pleckstrin), un domeniu central PTB (Phosphat-Tirozin Binding), un domeniu C-terminal cu multiple locuri potenţiale de fosforilare a tirozinei şi regiuni bogate în prolină care ar putea servii ca locuri doking pentru proteina ce conţine SH2 şi SH3. Gena DOK-L se exprimă predominant în măduva osoasă, splină şi plămâni, deşi o exprimare de nivel scăzut a mRNA poate fi detectată şi în alte ţesuturi. DOK- L se cuplează în manieră dependentă de kinază prin domeniul lor PTB, la TK Abelson. În celulele de drojdii şi în cele mamaliene dependent de kinază in vivo DOK-L este fosforilată de TK Abl. Dimpotrivă, faţă de p62 (DOK), DOK-L nu are locusurile YxxP la terminusul C şi nu cuplează la proteina ce activează după fosforilarea GTP-ază Ras (Ras GAP).

Hiperexprimarea DOK-L, dar nu a p62(DOK) supresează activarea MAP kinazei (Proteina Activatoare de Mitogen) indusă de v-Abl, dar nu are efect pe activarea kinazei constitutiv activată de Ras şi EGF. Efectul inhibitor reclamă domeniul PTB al DOK-L. Hiperexpresia DOK-L în celulele NIH 3T3 inhibă activitatea transformantă a v-Abl. Se sugerează astfel că, DOK-L poate modela funcţia Abl (18).

 

 

Factorii care activează c-Abl

 

Activarea macrofagelor indusă de endotoxina LPS este importantă în imunitatea nespecifică şi în represia indusă de endotoxină în condiţiile stimulării excesive a macrofagelor. Reducerea c-Abl în macrofage previne oprirea creşterii indusă de LPS, producţia de NO şi secreţia TNF-alfa de către macrofagele ANA-1 care continuă să crească dar ulterior suferă apoptoza. Reducerea c-Abl din celule, duce la activitatea redusă a kinazei-Abl asociată cu Ran care recent este declarat ca fiind produs de o genă ce răspunde la LPS. Se sugerează că tirozin kinaza c-Abl este un intermediar aval de semnalul iniţial de transducere a semnalului de activare a macrofagelor de către LPS (19).

Produsul genei Pag sau proteina MSP23 (Macrofage Stress Protein 23kD) induce proteine cu activitate antioxidantă, implicate în răspunsul celulelor la stresul oxidativ şi în controlul proliferării şi diferenţierii celulare. Pag se asociază cu c-Abl in vivo şi inhibă tirozin fosforilarea indusă de hiperexpresia c-Abl. Inhibarea reclamă Abl SH3 şi domeniul kinazei. Expresia Pag inhibă, de asemenea, in vitro, activitarea kinazei c-Abl dar nu a Abl SH3 mutantă sau a v-Abl. Se sugerează astfel că in vivo Pag este un inhibitor fiziologic al c-Abl, deci manifestă efect de citostatic indus de c-Abl. (20)

Expresia genei Pag creşte în celulele sincronizate ce intră în faza S, ceea ce indică posibilitatea ca nivele înalte de Pag să contracareze activitatea citostatică a Abl. Tratarea celulelor cu agenţi oxidativi dietilmalat şi arsenat de sodiu, care stopează creşterea celulelor, induce hiperexpresia genei Pag, independent de proliferarea celulelor. Deci, expresia amplificată a genei Pag apare în proliferarea celulelor ca răspuns la stresul oxidativ (21).

TK c-abl este activată de radiaţiile ionizante (IR) şi de alţi factori printre care unii care lezează DNA. S-a constatat că c-Abl se asociază constitutiv cu PKC-delta, domeniul SH3 al său interacţionând direct cu aceasta. De asemenea, c-Abl fosforilează şi activează in vitro PKC-delta. Iradierea celulelor induce fosforilarea PKC delta dependentă de c-Abl ca şi translocaţia acestei kinaze în nucleu. Se subliniază astfel existenţa unei interacţiuni funcţionale între c-Abl şi PKC-delta în răspunsul celulelor la stres genotoxic. (22)

 

Influenţa ABL asupra altor factori

 

Proteina Rad 51, un omolog al RecA bacterian, intervine în repararea dublei catene DNA rupte. Cum menţionam, TK c-Abl este activată de iradiaţii ionizante şi de alţi câţiva agenţi care lezează DNA. Se ştie că c-Abl interacţionează constitutiv cu Rad 51, pe care o fosforilează in vitro la Tyr-54. Iradierea celulelor induce fosforilarea Rad 51 de către c-Abl proces care inhibă cuplarea proteinei Rad 51 la DNA şi deci inhibă funcţia acesteia în reacţiile schimbării catenei DNA dependentă de ATP. În premieră s-a semnalatfaptul că Rad51 este reglată prin fosforilare şi suportă acţiunea c-Abl în reglarea recombinării dependente de Rad 51 ca răspuns la lezarea DNA (23).

Gena umană ST5 codifică 3 proteine cu masamoleculară predicată a fi de 126, 82 şi respectiv 70kD. S-a urmărit activitatea acestei gene în căile de transducţie a semnalelor. Astfel in vitro, p126 cuplează preferenţial la c-Abl SH3 competitiv cu alte domenii SH3, inter-activitate mediată de secvenţele PR-2 (p126 conţine două secvenţe bogate în prolină-PR-1 şi PR-2). In vivo expresia p126, dar nu a p82 sau p70, activează în celulele COS7 MAPK (Mitogen - Activated- Protein- Kinase) ERK2 (Extracelular Signal Regulated Kinase -2) ca răspuns la EGF. Expresia c-Abl cu p126 amplifică enorm această activitate. Deleţia PR-1 blochează abilitate p126 de a activa ERK-2, iar deleţia PR-2 nu-i afectează activitatea bazală dar blochează efectul stimulator al c-Abl.Se sugerează că ST5 poate funcţiona ca o proteină de semnalizare şi poate oferi o legătură între c-Abl şi ERK-2(24).

Activitatea de TK a proteinei de fuziune BCR/ABL joacă un rol important în patogeneza leucemiilor. Proteina abl interacţionează specific cu proteinaretinoblastomului Rb în timpul ciclului celular. S-a analizat posibila interacţiune a BCR/ABL în linia celulară Ph+. P145 c-abl ca şi proteinele p190 şi p210 BCR/ABL interacţionează cu pRb. Proteinele
c-Abl şi BCR-ABL se asociază atât cu formele fosforilate cât şi cu cele nefosforilate ale pRb. Se apreciază că BCR/ABL interferă cu funcţia pRb şi astfel reglează creşterea celulară (25).

Familia factorilor de transcriere E2F reglează progresia ciclului celular, iar expresia dereglată a acestora poate conduce la transformare malignă.

Introducerea şi expresia virusului Abelson în celulele mieloide determină indepen-denţă faţă de factorii de creştere, deoarece p120 v-Abl activează transcrierea mediată de E2F-1 printr-o interacţiune fizică cu acesta. BCR/ABL şi c-ABL, de asemenea, stimulează transcrierea mediată E2F-1. Se sugerează un mecanism prin carec-abl determină proliferarea celulelor mieloide independent de factorii de activare transcripţională mediată de E2F-1. (26)

S-a urmărit dacă Bcr care este tirozin fosforilată în celule de către c-Abl activată ar putea cupla Grb-2 şi dacă fosfotirozina Y177 este locul major de cuplare. S-au analizat complexele Bcr şi Abl într-o linie celulară hematopoietică şi în celulele COS-1 constatându-secoexprimarea atât în proteina Bcr, cât şi în Abl. Se relevă că Bcr tirozin-fosforilată este capabilă să cupleze Grb-2, dar Bcr tirozin fosforilată Y177 este deficientă în cuplare. Complexul Grb-2 -Bcr poate fi considerat un potenţial activator al căii ras. (27)

 

 

BCR/ABL

 

Aşa cum s-a menţionat, BCR/ABL este o oncogenă himerică generată de translocaţia secvenţei din gena protein-tirozin kinazică c-Abl de pe cromozomul 9, lângă gena BCR de pe cromozomul 22 constituindu-se astfel cromozomul Philadelphia ce caracterizează unele leucemii umane . Sunt două tipuri majore de fuziune BCR/ABL. Fuziunea amino acidului 426-N-terminal-BCR generează proteina p190 (BCR-ABL) care abundă în LLA (Leucemia Limfocitică Acută), pe când fuziunea N-terminal aminoacidul 902 sau 927 BCR generează proteina p210 (BCR/ABL) întâlnită mai frecvent în CML (Leucemia Mielogenă Cronică). În câteva linii de CML se constată o expansiune clonală a celulelor stem hematopoietice. Pacienţii cu CML în faze stabile au, de obicei, în sângeun număr crescut de leucocite şi celule imature ale liniei granulocitare. Faza stbilă de CML tipică între 3,5-5 ani este similară ca agresivitate cu leucemia acută în momentul când este blocată diferenţierea celulelor. Tranziţia CML din faza stabilă în cea blastică este reflectată prin pierderea necesităţii de factori de creştere pentru celule CML şi se corelează cu alterările citogenetice adiţionale.

Unele efecte biologice ale celulelor CML primare includ apoptoza redusă şi adeziunea alterată la fibronectină. Totuşi, celulele sunt dependente de factorii de creştere hematopoietici.

Amplificarea activităţii TK -Abl în BCR/ABL este crucială pentru transformare; astfel, TK conduce la activarea câtorva căi de transducţie a semnalului, care, de asemenea, sunt utilizate de factori de creştere hematopoietici printre care trombopoietina, IL-3, GM-CSF şi factorul Steel.

În câteva sisteme model, BCR/ABL ridică problema efectelor biologice ale factorilor de creştere hematopoietici presupunând că aceste sisteme sunt dependente de ei (28).

Efectul tumorogenic al oncogenei BCR/ABL este mediat de Bcl-2, o proteină esenţială pentru transformare. S-a stabilitîn celulele transformate că gena Bcl-2 este o genă ţintă aval de calea de semnalizare ras şi de asemenea că, activarea constitutivă a lui ras conduce laexpresia constitutivă a genei BCR/ABL. O formă trunchiată a acesteia, căreia îi lipseşte o regiune critică BCR reclamată pentru activarea căii de semnalizare ras, nu induce expresia Bcl-2. Astfel, gena BCR/ABL, previne apoptoza indusă de Bcl-2 printr-o cale de semnalizare care implică ras şi leagă activarea constitutivă a lui ras cu reglarea genei Bcl-2. De aici ideea că ras ar fi implicată atât în semnalizarea mitogenică, cât şi în calea de supravieţuire a celulelor (29).

În p190 cât şi în p210 sunt prezente capetele N-terminal ale BCR (aminoacizii 1-63) care funcţional pot fi înlocuiţi cu leucine ZIPPER al factorului de transcriere GCN4 din drojdii. Proteina ZIPP-BCR/ABL care transformă celule Rat-1/myc este autofosforilată pe tirozină şi localizată predominant pe filamentele de actină. Astfel, homooligomerii pot activa TK şi funcţia lui ABL de a cupla pe F-actină, fie prin BCR fie prin GCN4. S-a stabilit că fuziunea BCR/ABL care conţine numai aminoacizii lui BCR (1-191), poate, de asemenea, transforma eficient celule Rat-1/myc. Fuziunea secvenţelor adiţionale ale BCR(aminoacizii 192-23) nu are efect transformant pe aceste celule, dar reduce progresiv ruperea citoscheletului de actină.

În particular, domeniul omolog Dbl prezent în p210 (BCR/ABL), dar nu în p190 (BCR/ABL) contibuie la stabilizarea fibrelor de actină. Efectul modulator al secvenţei BCR asupra structurii actinei subliniază variaţiile aparent partogene dintre diferitele proteine de fuziune BCR/ABL (30).

Proteina Abl şi oncoproteinele v-Abl şi BCR/ABL pot activa membrii familiei proteinelor STAT (de semnalizare, transducţie şi activare a transcrierii) în celule transformate de v-Abl, tirozinkinazele Janus (JAK) sunt activate constitutiv. În aceste celule, oncoproteina v-Abl şi kinazele JAK sunt asociate fizic. Cartarea domeniillor de interacţiune dintre oncoproteină şi JAK arată că aminoacizii din regiunea COOH-terminasl a v-Abl cuplează direct kinazele JAK.

O mutantă a v-Abl, care exclude această regiune nu cuplează şi nu activeazăJAK-1 in vivo, nu activează proteina STAT şi nu induce proliferarea celulelor. Mutantele din molecula JAK-1 inhibă abilitatea v-Abl de a activa STAT şi de a induce proliferarea celuleleor transformate în măduva osoasă. Aceste efecte se corelează cu defectele în activarea de către
v-Abl a câtorva căi inclusiv Akt, PI3 kinaza, STAT şi Ras. Astfel, JAK kinaza poate juca un rol important în transformarea celulară indusă de v-Abl (31).

Mutantele TK BCR/ABL sensibile la temperatură sunt folosite pentru studierea mecanismelor transformării celulare şi transducţiei semnalelor. In vivo, activitatea tirozinkinazică a p210, p190 BCR/ABL şi v-Abl sensibilă la temperatură, exprimată în celulele hematopoietice, declină când temperatura creşte cu 2°C peste nivelul normal.

In vitro, activităţile tirozinkinazice ale Abl recombinat purificat şi p210 BCR/ABL sunt, de asemenea, sensibile la temperaturi crescute. După 16 ore la 39°C fosforilarea tirozinei proteinelor celulare este marcat redusă în celulele transformate de BCR/ABL, în timp ce expresia acesteia rămâne neschimbată. Reglarea redusă a activităţii kinazei BCR/ABL indusă de temperatură este reversibilă când celulele sunt aduse la 37°C. Scăderea acestei activităţi nu este influenţată de mutaţii sau de deleţia domeniilor SH2 sau SH3, sau de mutaţia locului de cuplare GRB2. Scăderea activităţii TK indusă de temperatură se corelează cu declinul în fosfotirozinază asociată cu PI3-kinaza şi nu apar schimbări în independenţa factorilor de creştere a celulelor hematopoietice transformate. Deci TK Abl deţine sensibilitatea intrinsecă la temperatură, iar activitatea BCR/ABL exprimată în celulele hematopoietice scade odată cu creşterea temperaturii cu 2°C (32).

În ideea înţelegerii mecanismelor moleculare ale transformării celulare mediată de Bcr/Abl s-au clonat şi desemnat două cDNA parţiale-Shd şi She, care codifică proteine ce conţin domeniul SH2. Ambele DNA au omologii cu proteina Shb care conţine, de asemenea, domeniul SH2. DNA She se exprimă în inimă, plămâni, creier şi muşchii scheletici, iar DNA Shd este restrictat în creier.

Secvenţele de aminoacizi deduse din cDNA Shd de lungime deplină de la şoareci conţin o regiune amino-terminal bogată în prolină şi un domeniu carboxi-terminal SH2. Domeniul Shd exprimat în bacterii cuplează multiple proteine tirozin-fosforilate cu g.m. de 200, 170, 130, 100, 90, 78, 72 şi 32kDlizate de celule K562. Acest domeniu conţine 5 motive YXXP - secvenţă substrat preferată de TK-Abl. De asemenea, este tirozin fosforilat în celulele COS-7 cotransfectate cu Shd şi Abl sau cu Bcr-Abl. Se sugerează că domeniul Shd poate fi un substrat fiziologic al c-Abl şi poate funcţiona ca o proteină adaptor în sistemul nervos central (33).

 

Rolul proteinei adaptor CRKL în transducţia semnalului în celulele hematopoietice normale şi în cele transformate de BCR/ABL

 

CRKL este o proteină adaptor de 39kD, a cărei genă a fost originar clonată în proximitatea genei BCR pe cromosomul 22, având rol reglator cheie în celulele hematopoietice. Deţine un domeniu SH2 şi două domenii SH3 cu 60% omologii cu CRKII. În leucemia cronică mieloidă CRKL este un substrat al oncoproteinei BCR/ABL şi cuplează la aceasta dar şi la ABL. Ca răspuns la receptorii factorilor de creştere hematopoietici normal, CRKL este tirozin fosforilată semnalizând liganzi precum trombopoietină, eritropoietină sau factorul Steel. Este, de asemenea, implicată în semnalizarea iniţiată de cuplarea încrucişată a integrinei beta, cu receptorii limfocitelor B şi T. Structural, domeniul SH3-amino-terminal al CRKL cuplează proteinele C3G, SOS, P13, c-ABL sau BCR/ABL. Domeniul său SH2 poate cupla la proteinele tirozin-fosforilate CBL, HEF1, CAS sau paxillin (34).

În linia transformată de BCR/ABL, CKRL este tirozin-fosforilat dar CRK nu. Urmărindu-se schimbarea în proteinele care cuplează CRK şi CRKL în linia hematopoietică Ba/F3 transformată de BCR/ABL s-a constatat că proteina care cuplează domeniul SH3 CRKL nu se schimbă cu excepţia faptului că BCR/ABL coprecipită cu CRKL.

În celulele hematopoietice netransformate există trei proteine majore care coprecipită cu CRKL: C3G, SOS şi c-Abl, fiecare interacţionând cu domeniul CRKL-SH3 dar nu cu domeniul CRKL-SH2. Comparativ cu CRKL foarte puţină proteinăcoprecipită cu CRKII în celulele netransformate inactive. După transformarea BCR/ABL domeniile CRKl şi CRK-SH2 cuplează la un complex de proteine cu g.m. de 105-120kD. În acest complex proteina majoră este p120 CBL. Astfel că, în acestă linie hematopoietică CRKL este implicată în căile de semnalizare normale mult mai mult decât CRKII care implică cele trei proteine majore. În celulele transformate de BCR/ABL, CRKL şi nu CRKII formează complexe care leagă potenţial proteinele BCR/ABL, C-ABL, C3G şi SOS cu protooncoproteina p120 CBL (35)

În concluzie CRKL este o proteină adaptor SH2-SH3-SH3, substrat major al oncoproteineiBCR/ABL, însă funcţia ei în celulele normale nu este cunoscută. În celulele transformate de BCR/ABL ea se asociază cu proteinele de adeziune focală, tensina şi paxilin, ceea ce sugerează că ar putea fi implicată în semnalizareaintegrinei. În liniile hematopoietice MO7e şi H9, CRKL se asociază rapid cu o proteină tirozin-fosforilată, ulterior cuplării încrucişate a integrinei beta cu fibronectina sau cu anticorpul monoclonal anti-integrina beta1. În celulele MO7e proteina majoră pe care o cuplează CRKL este p120 (CBL), omologul celular al oncoproteinei v-CBL. În linia limfoidă H9, proteina tirozin-fosforilată cuplată de CRKL este p110 (HEF1). În ambele cazuri, această cuplare este mediată de domeniul SH2 al CRKL.

În cele două tipuri celulare, CRKL este constitutiv complexată de C3G, SOS şi c-ABL, prin domeniul său SH3. Stoichiometria acestor complexe nu se schimbă după legătura cu integrina. Astfel că, în diferite tipuri celulare, CRKL şi proteinele sale asociate cu SH3 poate forma diferite complexe multimerice în funcţie de ligaţia integrinei cu p120 (CBL) sau cu p110 (HEF1) tirozin-fosforilate. Înfuncţie de aceste reacţii are loc şi semnalizarea integrinei în diferite celule (36).

Bhat şi colab. (37) confirmă că CRKL este o proteină adaptor care conţine domeniile SH2 şi SH3, domenii care cuplează direct la BCR/ABL şi la c-CBL tirozin-fosforilată.

 

 

Abl în diverse patii

 

Gena mutantă în ataxia telangiectazică (AT), boală autosomal recisivă desemnată ATM (pentru gena din AT mutantă) este membru al unei familii de enzime fosfatidil inozitol-3-kinază-like, implicată în controlul ciclului celular, recombinarea meiotică, monitorizarea lungimii telomerelor şi în răspunsul la lezarea DNA. Celulele din AT sunt hipersensibile la radiaţii ionozante şi sunt defective în stoparea fazelor G1/S ale ciclurilor celulare, după lezarea DNA prin iradiere.

Deoarece celulele care nu conţin proteina TK-c-Abl sunt, de asemenea, defective în stoparea fazei G1 indusă de radiaţii, s-a urmărit posibilitatea ca ATM ar putea interacţiona cu c-Abl în răspunsul la acest tip de lezare a DNA. S-a demonstrat astfel că, ATM cuplează constitutiv c-Abl în controlul celulor. Domeniul SH3 al c-Abl interactionează cu motivul DPAPNPPHEP (reziduul 1,373-1,382) al ATM, de asemenea activitatea TKc-Abl indusă de radiaţii este diminuată în celulele din AT. Astfel, ATM este implicată în activarea c-Abl prin lezarea DNA, această interacţiune putând media, în parte, stoparea fazei G1 indusă de radiaţii.

Radio sensibilitatea este un marker major al dezordinii genetice din AT uman, demonstrat in vivo după expunerea pacienţilor la doze terapeutice de radiaţii, dar şi în culturi celulare. Pacienţii cu acest sindrom sunt predispuşi la apariţia unor leucemii şi limfoame, ceea ce explică interesul pentru legătura dintre radio-sensibilitate şi predispoziţia la cancer.

Ataxia telangiectazică este o afecţiune umană rară, recesiv autosomală cu fenotipuri pleiotrope precum degenerarea neuronală, disfuncţia imunitară, senescenţa prematură şi riscul crescut de cancer. Produsul modificat al genei ATM conduce in vitro la activarea c-Abl, prin fosforilarea TK-c-abl la serina 465. O mutantă cu serina 465 înlocuită de alanina 465 nu se mai activează in vivo la iradiere sau cu ATM-kinază. TK-c-Abl este astfel o ţintă în avalul fosforilării şi activării de către această kinază, în răspunsul celulelelor la radiaţii ionozante (40).

Proteina 60 gaga virusului MAIDS murin (AIDS murin) defectiv, promotează proliferarea celulară şi induce imunodeficienţă severă infectând şi limfocitele B. Domeniul SH3 a p-Abl interacţionează cu domeniul bogat în prolină, p12, al p60gag. În celulel B infectate cu virusul MAIDS cele două proteine se asociază atât in vitro cât şi in vivo. Hiperexpresia p60gag în aceste celule duce la creşterea nivelelor proteinei ABL şi la translocarea acesteia pe membrană. Se sugerează că acestă proteină virală serveşte ca loc de acţiune pentru moleculele de semnalizare şi că de asemenea, Abl poate fi implicat în proliferarea limfocitelor B infectate (41).

Proliferarea excesivă a ţesutului mieloid în măduva osoasă a pacienţilor cu leucemii acute sau cronice cu cromosomul Ph+ este atribuită unei TK BCR/ABL, hibrid hiperactiv produs al fuziunii dintre exonul secund al protooncogenei c-ABL de pe cromosomul 9 şi porţiunile 5'ale genei BCR de pe cromosomul 22.Acest eveniment molecular (translocaţie) este influenţat de drogul inhibitor al tirozinkinazei-CGP-57148, în celulele mamaliene transfectate cu gena BCR/ABL de lungime deplină celule care exprimă proteina de lungime deplină p210 BCR/ABL ca şi în celulele leucemice primare care exprimă acestă proteină. Investigaţiile s-au efectuat pe pacienţi ale căror celule exprimau p190 BCR-ABL şi pe cei ale căror celule exprimau p210 BCR/ABL, ca şi pe celule blaste infectate.

In vitro în interval de 24-48 ore CGP-57148 induce apoptoză extinsă în celulele care exprimă BCR/ABL dar nu şi în cele BCR/ABL negative. Se constată, de asemenea, efect supresiv temporar asupra celulelor clonogenice KBM-5 comparabil cu efectul expuneriila CGP-57148. Pentru diferitele tipuri celulare, doza şi timpul de expunere sunt variabile; astfel că, pentru celulele lipsite de proteina BCR/ABL dozele efective sunt inofensive. Deci, expunerea continuă a celulelor ţintă poate fi variantă importantă în stabilirea terapie (42).

Celulele blasticeK562 sunt independente de factorii de creştere. TK-bcr-Abl exprimat constitutiv ar putea fi responsabile de menţinerea stării de blast în celulele din CML. Celulele K-562 tratate timp de 72 ore cu inhibitori ai TK-quercetin şi genistein- au fost analizate pentru expresia apoptotozei. Cele tratate cu quercetin nu se diferenţiază şi suferă apoptoza în proporţie de 68% comparativ cu 7% de celulele de control. Celulele tratate cu genistein relevă 16% apoptoză şi 15% diferenţiere eritroidă. Quercetin reduce cu 74% nivelul p210 iar fosfotirozina acesteia este 67,6%. Genisteinul reduce p210 cu 77,8% iar fosfotirozina era 16%. Se conclude că, ambii agenţi pot scădea activitatea tirozinkinazică a p210având diferite efecte; quercetinul produce apoptoză în timp ce genisteinul produce atât diferenţiere cât şi apoptoză (43).

Cum s-a menţionat, activitatea tirozinkinazică a oncogenei BCR/ABL este reclamată pentru transformarea celulelor hematopoietice. Inhibitorul tirozinkinazic STI571 (numit iniţial CGP57148B) inhibă activitatea kinazică a BCR/ABL, TEL/ABL şi v-ABL, şicreşterea şi viabilitatea celulelor transformate de oricare din aceste oncogene ABL.

S-au generat două linii celulare BCR/ABL care au rezistenţă parţială la inhibitorul STI571, respectiv, celulele hematopoietice Ba/F3 transformate de BCR/Abl şi celulele umane K562 Ph+, care au fost cultivate câteva luni cu concentraţii gradat crescute de inhibitor, în ideea generării de linii rezistente. Celulele rezistente BaF3.p210 arată mRNA BCR/ABL crescut, amplificarea transgenei BCR/ABL şi creşterea de peste 10 ori a nivelului proteinei BCR/ABL. Dimpotrivă, celulele K562 rezistente la drog nu suferă amplificare detectabilă a genei BCR/ABL, deşi arată o creştere de 2-3 ori a proteinei p210BCR/ABL. Adausul de inhibitor la ambele tipuri celulare conduce la o rapidă scădere a fosforilării tirozin-proteinei celulare, similar cu cea observată la celulele nerezistente. Totuşi, inhibarea activităţii kinazice este tranzitorie, parţială şi nu este însoţită de apoptoză. (44)

 

 

Gena ARG

 

Genele ARG şi c-ABL sunt membrii ai familiei Abelson de PTK (Protein Tirozin Kinază) mamaliene. SH2 şi domeniul kinazei Arg arată identitate de 90%, cu cele ale c-Abl. Touşi, aceste două proteine deţin în regiunile C-terminal numai 29% identitate.

Fosforilarea RNA polimerazei 2 de către c-abl reclamă prezenţaTK, domeniul SH2 şi un domeniu care interacţionează cu CTD (domeniul C-terminal repetat) din proteina Abl. CTD se întâlneşte şi în regiunea C-terminal a Arg. Se sugerează că, tirozinfosforilarea RNA polimerazei II CTD ar putea fi catalizată fie de kinaza c-abl, fie de kinaza Arg.

S-a izolat o nouă proteină-Arg BP-2- care conţine trei domenii Arg COOH terminal, omoloage cu COOH terminal src, un domeniu bogat în serină/treonină şi câteva potenţiale locuri de fosforilare a abl. Această nouă proteină este frecvent exprimată în ţesuturi umane fiind extrem de abundentă în inimă. În celulele epiteliale este prezentă în citoplasmă şi nucleu similar cu repartizarea p-abl. În celulele cardiace proteina Arg BP-2 este localizată la nivelul discurilor Z ale sarcomerelor. Se sugerează că, această proteină funcţionează ca o proteină adaptor pentru asamblarea complexelor semnaldin fibre şi ca o potenţială legătură între kinazele familiei abl şi actina citoscheletului. În plus, localizarea ei în discurile Z sugerează că poate influenţa proprietăţile contractile sau eleastice ale sarcomerelor cardiace, discurile Z fiind ţinte ale cascadelor transducţiei semnalelor (45, 46).

 

Cuprins

© University of Bucharest 2002. All rights reserved.

No part of this text may be reproduced in any form without written permission of the University of Bucharest, except for short quotations with the indication of the website address and the web page.

Comments to: Dumitru Mişcalencu, Lăcrămioara Ivanciu, Florica Mailat, Cristina Bordea
Last update: September 2002
Text editor: Monica CIUCIU