Gena c-jun este transcrisa imediat dupa stimularea celulelor cu mitogeni. Ea codifica o fosfoproteina de 39 kD reprezentând componenta majora AP-1(proteina activatoare-1) a complexului de reglare transcriptionala
Din familia genei jun, pe lânga c-jun, mai fac parte si genele jun-B si jun-D, ambele fiind factori de transcriere cu un domeniu de transactivare N-terminal si unul de cuplare la DNA compus dintr-o regiune bazica si un motiv “zipper” leucina în capetele sale C-terminale.
Prin intermediul motivului “zipper” (leucinei), proteina Jun poate forma homo- sau heterodimeri ce vor cupla la DNA, exprimându-si astfel functia de reglator transcriptional. Proteinele Jun pot forma heterodimeri si cu proteinele reglatoare ale transcrierii elaborate de alte gene cum sunt genele familiei fos, conditie în care raspunsurile transcriptionale vor diferi în timpul dezvoltarii si diferentierii celulare.
Rolul esential al genei c-jun ar fi în tranzitia din faza G0 în faza G1 a ciclului celular pe care-l controleaza. Actioneaza asupra altor gene prin siturile AP-1 ale acestora, situri pe care le detine ea însasi în promotorul sau asupra caruia se poate actiona cu forbol ester (1).
AP-1 a fost prima proteina identificata ca factor transcriptional care recunoaste în promotorul genelor, situsul TRE (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetat response element). Desi c-jun si c-fos codifica componente ale factorului de transcriere ce stimulreaza expresia variatelor gene tinta în raspunsul la TPA (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetat), propria lor transcriere este indusa, de asemenea, dupa activarea PKC. În celulele umane, inductia mRNA c-jun de catre TPA, desi tranzitorie, dureaza mai mult decât inductia c-fos, transcriptul c-jun având o stabilitate crescuta.
Când complexul AP-1 controleaza expresia genelor implicate în proliferarea celulelor, expresia c-jun si c-fos creste rapid în numeroase tipuri celulare, ca raspuns la actiunea mitogenilor EGF, TGF-alpha, PDGF etc. Nivelele mRNA c-jun au o crestere logaritmica. Fiind un activator nuclear AP-1 cu componentele ei actioneaza direct pe genele implicate în crestere si diviziune necesitând semnale care vin în cascada din momentul cuplarii unui factor de crestere la un receptor de pe plasmalema celulei (2).

Factorii care influenteaza activitatea genelor jun

Factorii care influenteaza activitatea genei c-jun pot fi atât pozitivi cât si negativi. Astfel, silymarin, un flavonid polifenolic derivat din Silybum marinum, cunoscut ca un antiinflamator, citoprotector si anticancerigen, implica supresia NF-kB (factor de transcriere nucleara) si regleaza diferite gene care intervin în inflamatie.
Silymarin nu afecteaza activitatea AP-1, dar inhiba activitatea PK indusa de TNF si N-terminal c-jun kinaza, abrogând astfel citotoxicitatea TNF ca si activitatea caspazei (3).
Se sugereaza ideia ca, adenilat ciclaza pare a fi implicata în hiporeglarea expresiei mRNA c-jun pe calea PKA. În plus,canalele de Ca2+ tip L, calmodulin si PKII-dependenta de Ca2+/calmodulin, pot fi partial implicate în hiporeglarea m-RNA c-jun indusa de forskalin (4).
Fibroblastele de soareci 3T3 derivate din fetusi lipsiti de c-jun, (principalul component al factorului de transcriere AP-1), în raspunsul celular la agentul alkilant metansulfonat (MMS), este cel mai potent si selectiv activator al JNK/SAPK ( kinaze induse de stres) si al p38, rezultând o foarte eficienta inductie a hiperfosforilarii si transcrierii genei.
Agentul alkilant induce apoptoza cu înalta eficienta în celulele tip-salbatic, dar nu în cele c-jun-/-. Rezistenta la apoptoza este însotita si de expresia alterata a ligandului CD95 (CD95L), un cunoscut inductor al apoptozei. Adausul de rCD95L restaureaza sensibilitatea la apoptoza în fibroblastele c-jun-/- Apoptoza indusa de MMS în fibroblastele de tip-salbatic sau în leucocite umane este, puternic redusa prin neutralizarea ligandului cu anticorpi anti-CD95L. c-jun poate actiona ca un reglator pro-apoptotic în celulele expuse lezarii DNA via inductiei CD95L. Odata semnalizata moartea celulei indusa de CD95, aceasta nu este afectata de absenta c-jun, subliniindu-se faptul ca numai initierea si nu procesul apoptotic indus de stres depinde de c-jun (5).
Calpoinele (cistein-proteaze citoplasmatice activate de Ca2+) actioneaza asupra factorilor de transcriere c-fos si c-jun care raspund cu înalta sensibilitate. Integritatea structurala a monomerilor c-fos si c-jun nu este cruciala pentru a fi recunoscuta de calpoine (6).
JNK (c-jun-N-terminal kinaza) are diferite functii. Recent s-a aratat ca în plachetele ERK2 aceasta kinaza este activata de trombina si hiporeglata de angajarea integrinei beta(3)alpha (IIb). JNK-1 este prezenta în plachetele umane fiind activata de trombina, si fosforilata la concentratii scazute de trombina. În conditiile inhibarii cuplarii fibrinogenului la integrina alpha(IIb)beta(3) s-a demonstrat ca activitatea JNK-1 este reglata negativ.În premiera, s-a relevat ca MAP-kinazele si JNK-1 sunt reglate negativ de dispunerea integrinei (7).
N-4 hydroxy phenil retinamida (4-HPR), un analog al acidului retinoic induce apoptoza prin activarea sustinuta a JNK (c-jun-N-terminal kinaza) în linia celulara de carcinom de prostata -LNCaP p53+/+- care este sensibila la androgeni, dar nu în linia celulara PC-3 p53-/- care este insensibila la androgeni. Activarea JNK de catre 4-HPR este dependenta de caspaza, deoarece un inhibitor al acesteia opreste activarea kinazei.
Iradierea cu UV-C si UV-gamma induce activarea JNK în ambele linii celulare, sugerând ca imposibilitatea celulelor PC-3 de a raspunde la 4-HPR se datoreaza defectelor amonte de calea JNK. Curcuminul inhiba,de asemenea, activitatea JNK, concluzia fiind ca pe calea JNK se produce semnalizarea apoptotica declansata de 4-HPR (8).
Recent s-a identificat o noua PK activata de mitogeni (MAP-kinaza) care regleaza semnalul apoptotic (ASK-1) ce activeaza caile JNK (c-jun N-terminal kinase) si p38 MAP kinaza cu roluri pivotale în apoptoza indusa de TNF si Fas . Hiperexpresia ASK-1-DeltaN, o noua proteina MAP, activeaza JNK si induce apoptoza în celulele PC-12 diferentiate si în neuronii simpatici SCG (9).
c-jun contribuie la moartea neuronilor indusa de A beta (amiloidul beta). Totusi, neuronii deficienti în c-jun sunt relativ rezistenti la toxicitatea cu acest amiloid.. În neuronii tratati cu A beta, în paralel cu schimbarile în expresia genei, se constata si o aparenta activare a promotorului c-jun, atât în cei deficienti în c-jun cât si în cei de tip salbatic. De asemenea, alte câteva gene cum sunt c-fos,fos-B, ngfi-B si I-kappaB au fost induse de A beta în neuronii de tip-salbatic (10).
jun-B. Expresia amplificata a acestei gene este mediata de alterarile factorilor cuplati la elementul TATAA. Transcrierea ei amplificata se asociaza specific cu expresia v-src si nu poate fi reprodusa prin expresia unui vector c-src, v-Ha-ras sau v-raf. Mutatia punctiforma a elementului TATAA din gena jun B aboleste complet mutantele v-src sugerând ca proteinele cuplate la gena sunt modificate. Inductia ei este însa dependenta de activitatea crescuta a TK si de cuplarea ATP de catre proteina V-src. Se sugereaza ca proteinele src pot modula unii efectori nucleari pe cai ce implica produsele genelor celulare ras si raf. jun B, jun D si c-jun pot forma heterodimeri ce cupleaza la siturile specifice AP-1, dar difera în afinitatile de cuplare, relevând diferite activitati biologice si transcriptionale (11).
jun D. Sectionarea axonilor induce în pericarionul neuronilor, reactii morfologice, biochimice si functionale. Printre genele induse în acesti neuroni sunt si cele care codifica proteinele factorilor de transcriere; sunt asa numitele gene “de raspuns timpuriu” ce apartin familiilor jun, fos si krox ce sunt asociate cu cresterea si dezvoltarea sistemului nervos. Genele
c-jun, jun D, krox-20 si krox-24 sunt prezente în sistemul nervos adult, chiar în absenta oricaror stimuli intentionali. În hipocamp si izocortex, proteinele “de raspuns timpuriu” aparute în urma unei epilepsii induse, expresia jun-D si fos-B se pastreaza 24 ore (12).

c-jun si v-jun în transformare

Oncogena v-jun a fost descoperita ca parte a genomului ASV 17, un retrovirus cu replicare defectiva, izolat din fibrosarcomul spontan de pui; în acest caz produsul oncogenei este cuplat cu produsul genei gag în proteina Gag-Jun de 65 kD. În intentia de a se elucida de ce la pui structura v-jun este neoplazica, aceasta s-a comparat cu c-jun, demonstrându-se astfel ca, în jumatatea COOH-terminal a proteinei v-jun are loc substituirea a 2 aminoacizi, iar în jumatatea NH2-terminal are loc deletia a 27 aminoacizi. Pe lânga aceasta deletie, secventele c-jun de la soarece si om au o substitutie aditionala de aminoacizi, fata de c-jun de la pui (2).
v-jun induce alterari marcate în fibroblastele transformate în ce priveste reglarea ciclului celular în prezenta sau absenta contributiei factorilor de crestere. În timpul cresterii asincrone, fibroblastele transformate de v-jun se divid mai repede decât cele normale, timpul fazei G1 a ciclului fiind substantial redus. Fibroblastele normale dependente de mitogeni serici ies din ciclu si intra într-o sensibila stare de “liniste” (Go). Din contra, fibroblastele transformate de v-jun îsi continua ciclul si mentin un nivel ridicat al blastomului, ca si cresterea expresiei markerilor dependenti de ciclul celular, respectiv ciclina A, CDK2 (PK dependenta de ciclina).
Fibroblastele transformate sunt total dependente de factorii de crestere necesari multiplicarii celulelor. În conditiile saracirii serului, progresia ciclului celular este însotita de rate înalte ale apoptozei. În conditiile depletiei mitogenului, v-jun manifesta capacitatea de a promota progresia ciclului celular si apoptoza , capacitate proprie oncoproteinelor myc, E1A si E2F (13).
Prin nivelele mRNA, expresia c-jun este masiv redusa în celulele transformate de v-jun, datorita scaderii ratei transcrierii. Scaderea reglarii transcriptionaele este evidenta, deoarece promotorul c-jun este de 10 ori mai putin activ în celulele transformate decât în cele normale. Reducerea este atribuita unui motif TRE-like conservat în pozitia -72 (TRE jun proximal), motif esential pentru expresia de baza, eficienta în celulele normale, dar care confera activitate transcriptionala redusa sau chiar absenta în celulele transformate .
Elementul TRE jun proximal este recunoscut de mixtura c-jun/Fra si de complexul cAMP-responsiv element-binding protein/activating transcriptor factor-like din celula normala. Expresia ectopica a v-jun represeaza activitatea promotorului c-jun în celulele normale, prin TRE jun proximal, astfel ca, deficitul de transcriere mediat de TRE jun in vivo se coreleaza cu cuplarea v-jun la acest element.
Promotorul c-jun este refractar inducerii pe calea activarii prin stres a PK/c-jun NH2-terminal kinaza în celulele transformate de v-jun, sugerând ca aceasta din urma interfera cu expresia genei care regleaza semnalul. c-jun reprezinta astfel, un exemplu de gena celulara a carei transcriere in vivo este reglata negativ de v-jun (14).
Stimularea activitatii transcriptionale a genei c-jun via fosforilarii mediata de MAP-kinazele activate de mitogeni, stres sau de c-jun NH2-terminal (SAPK/JNK) depinde de un situs -regiune delta- din kinaza scurtata a domeniului activarii NH2-terminal, deletata în derivatul oncogenic v-jun. Aceasta mutatie amplifica marcat oncogenitatea v-jun, desi consecintele ei transcriptionale nu sunt rezolvate; aceasta reflecta incertitudinea faptului ca SAPK/JNK ar inhiba direct functia c-jun sau ar facilita si mentine specificitatea fosforilarii reglatoare pozitiva.
c-jun devine activa când se cupleaza la DNA via SAPK/JNK demonstrând ca acest proces nu exclude transactivarea. Se sugereaza ca SAPK/JNK activeaza primer ca un reglator pozitiv al transactivarii c-jun in situ si ca pierderea sitului scurtat fizic diminueaza activitatea c-jun (15).
v-jun ca si c-jun codifica o proteina ce cupleaza la DNA functionând ca factor de transcriere si este în acelasi timp componenta a complexului AP-1. Transformarea oncogenica prin v-jun este mediata de expresia aberanta a genelor tinta specifice. v-jun de lungime deplina a fost fuzionata cu forma sa NH2-terminal trunchiata la bindingul hormonal al receptorului estrogen uman. Cele doua proteine functioneaza ca transactivator ligand-inducibil. Expresia proteinei de fuziune în fibroblastele de pui determina transformarea dependenta de estrogen (16).

Genele tinta pentru proteinele Jun

Proteinele nucleare de transcriere actioneaza asupra promotorilor si enhancerilor diverselor gene carora le stimuleaza expresia. Proteina Jun actioneaza în complexul AP-1 dar si independent, fapt demonstrat recent. Astfel, JTAP-1-(o gena cathepsin-like) este înalt reglata ca raspuns la actiunea v-jun inducând transformarea celulara. Ea se hiperexprima de 7-10 ori în celulele CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) transformate de v-jun, comparativ cu hiperexpresia din celulele normale,
Omologia DNA si a aminoacizilor releva ca JTAP-1 este înalt similara cu peste 100 cistein-proteaze dintr-o varietate de specii si este asemanatoare cu omologul de la pui-cathepsina O-. Analiza expresiei în CEF a genelor v-Ha-ras, v-src, c-fos si myc în acelasi timp cu JTAP-1 releva ca hiperexpresia acesteia este unica în toate celulele transformate de v-jun. Astfel ca, JTAP-1 este o tinta specifica a v-jun hiperexprimata si nu o simpla consecinta a transformarii celulare (17).
Studiindu-se rolul semnalizarii PK indusa de EGF si factorul de transcriere c-jun în celulele carcinomului epidermal uman A413, s-a constatat expresia genei 12-lipoxigenazei. EGF creste activitatea ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) si JNK (NH2-terminal Kinaza c-jun).
Hiperexpresia c-jun amplifica expresia mRNA 12-lipoxigenazei si activitatea enzimei. Siturile Sp1-binding din regiunea promotor a genei 12-lipoxigenazei sunt necesare pentru activarea prin (legare) c-jun. Inductia ultima a c-jun prin activarea ERK si JNK este esentiala pentru acest raspuns (18).
Apolipoproteina A-1 este tinta negativa a hipoexpresiei v-jun. Hiporeglarea expresiei genei apolipoproteinei A-1 se face prin efectul asupra promotorului activ. O diminuare similara a reglarii acestei gene o poate determina myc si v-src, dar nu c-fos, v-Ha-ras, c-src sau c-ski. V-jun poate avea un efect potential reglator metabolic si asupra colesterolului (19).

Gena fos

Proteinele Fos declanseaza transcrierea unor gene, motiv pentru care sunt considerate proteine nucleare ce ocupa ultima treapta în cascada transmiterii semnalelor de la membrana celulei la DNA. Asociata cu proteina Jun, proteina Fos formeaza complexul AP-1 descoperit initial ca proteina care initiaza si declanseaza transcrierea unor gene.
Gena fos se exprima în timpul cresterii si diferentierii celulare. Proteinele familiei Fos sunt: c-Fos, Fos-B, Fra-1 si Fra-2. Dupa dimerizarea cu proteinele Jun, le creste atât afinitatea de cuplare cât si activitatea de transcriere. Proprietatile diferentiate ale heterodimerilor, ca si diversele interactiuni combinate ale proteinei Fos extind considerabil spectrul potential si specificitatea functiilor reglatoare ale acesteia.
Soarecii lipsiti de gena c-jun functionala mor, în parte, la mijlocul gestatiei, ceea ce demonstreaza ca c-jun este esentiala petru dezvoltarea normala. Cei care supravietuiesc au însa, defectiuni în osteogeneza, gametogeneza, neurogeneza si hematopoieza.
Protooncogena c-fos detine componente omoloage cu oncogena v-fos componente întrerupte de 4 regiuni introni, absente în genomul virusurilor purtatoare ale oncogenei. Atât la soareci cât si la om exista o regiune de 104 nucleotide care reprezinta secventele deletate în timpul biogenezei v-fos.
Proteina c-Fos este formata din 380 resturi de aminoacizi, remarcabil de similari cu ai proteinei v-Fos care este formata din 381 resturi de aminoacizi. Gena c-fos detine înca 104 nucleotide aditionale, care însa nu cresc dimensiunea transcriptelor. Primii 332 de aminoacizi ai proteinelor c-Fos si v-Fos de la soareci, difera numai în 5 reziduuri, în timp ce în ceilalti 48 aminoacizi, diferentele sunt mai mari si în consecinta, COOH-terminali ai celor doua proteine difera.
Genele de la soarece si om au peste 90% secvente omoloage, diferind numai în 24 reziduuri din totalul de 380. Virusul FBR (Finkel-Biskis-Reilly) MSV (Murine Sarcoma Virus) are genomul format din 3791 nucleotide care codifica un singur produs de fuziune gag-fos de 546 aminoacizi. Oncogena v-fos a osteosarcomului FBR induce tumori mezenchimale( osteosarcom, rabdomiosarcom, condrosarcom, liposarcom) si inhiba adipogeneza.
Virusul FBJ (Finkel-Biskis-Jinkins) (MSV-Murine Sarcoma Virus), care poarta v-fos induce, de asemenea, osteosarcom. DNA proviral FBJ contine 4026 nucleotide ce includ 2 LTR de 617 nucleotide fiecare, 1639 nucleotide din secventele celulare c-fos si un segment din anvelopa virionului-gena env. Codoanele initial si terminal ale genei v-Fos detin secvente dobândite care codifica o proteina de 381 aminoacizi, cu greutatea moleculara de 49.601.
În celulele transformate de FBJ-MSV s-a identificat pe electroforeza în gel poliacrilamida de SDS, o fosfoproteina transformanta de 55.000

Inductibilitatea genei fos

Ca raspuns la mitogeni sau agenti specifici, gena fos este indusa rapid, la câteva minute de la adausul inductorului aparând transcripte specifice c- fos. Frecvent, inductia este tranzitorie si precede în general, inductia altor proteine nucleare cum este si proteina genei myc. Dupa inductia cu TPA sau cu vitamina D3, gena c-fos se exprima în celulele U937 (linie promielocitica) sau în celulele HL-60 (linie monomielocitica), în 1-3 minute cu maximun la 30 minute. Nivelele transcriptiei genei declina în proportie de 20-25%, dar ramân neschimbate 10 zile. Proteina c-Fos necesara diferentierii mieloide se exprima numai 2 ore, nivelul maxim fiind atins la o ora.
Când fibroblastele”linistite” sunt tratate cu ser sau cu factorii de crestere PDGF, EGF, TPA (ester forbol), c-fos este indusa în 2-3 minute, cu nivele maxime (de peste 20 ori) la 20 minute si cu declin la o ora (20).
Prelucrarea celulelor NIH3T3 cu acesti factori de crestere, initiaza expresia genelor timpurii, printre care si c-fos, care la rândul ei activeaza expresia altor gene, cum este si gena transin. Stimularea cu TPA a acestei gene reduce expresia ei cu 50% si aceasta prin micsorarea selectiva a proteinei Fos.
Prin receptorii lor, PDGF si EGF interactioneaza cu segmentul reglator TGAGTCA localizat în regiunea promotoriala a genei transin. Acest segment este de fapt, un situs de legare a factorului de transcriere AP-1, în care componenta de baza este proteina Fos. Stimularea expresiei genei transin cu PDGF este blocata prin reducerea selectiva a proteinei Fos (21).
EGF determina cresterea marcata a mRNA c-fos si c-myc în cultura primara de celulele tiroidiene. Nivelul maxim este atins dupa 30 minute de la adausul de EGF, în timp ce nivelul mRNA c-myc creste dupa 30-60 minute cu un maxim atins la 90 minute (22).
Gena c-raf codifica o serin/treonin kinaza numita Raf-1 care raspunde de semnalele transmembranare si care în forma mutanta capata proprietati transformante. Proteina v-Raf, partenerul oncogenic al c-raf-1 poate transactiva transcrierea a doi promotori inductibili timpurii si anume: proteina c-Fos din celulele umane si murine si promotorul genei umane beta-actina (23).
Substantele care maresc concentratia intracelulara de cAMP conduc rapid si tranzitoriu expresia c-fos în celulele soarecilor. În promotorul acestei gene sunt elemente care participa la raspunsul cAMP în testul tranzitor. Situsul de legare, de baza al promotorului este localizat în 65pb din segmentul de initiere a transcrierii si corespunde cu situsul CRE la care se cupleaza diferiti factori celulari. cAMP induce astfel expresia c-fos în melanocite, gena stimulata la rândul ei de toxina holerica si de NGF (24,25).
Spre deosebire de IFN-gamma, IL-1 si TNF induc nivele marcate ale expresiei genei fos în celulele endoteliale umane în cultura. Nivelul maxim de mRNA apare la o ora dupa stimularea cu IL-1 si la 4-7 ore efectul dispare (26).
În urma incubarii cu angiotensina II-polipeptid care declanseaza constrictia vaselor, în celulele musculare netede ale aortei de sobolan se produce o crestere rapida a nivelului mRNA c-fos, care atinge maximum dupa 30 minute, ulterior scazând. Un efect similar asupra nivelului mRNA c-fos are si serul fetal de vitel. Angiotensina II stimuleaza expresia genei c-fos prin intermediul unor mediatori intracelulari cum sunt PKC si Ca2+ (27).
Inducerea protooncogenelor fos si sis, ca si a genelor proteinelor matricei extracelulare de catre butirat în procesul diferentierii gliomului F-98 la sobolan, nu influenteaza mRNA Ki-ras. Butiratul induce astfel reversibil mRNA fibronectinei si colagenului (28).
În linia celulara PC12 de feocromocitom s-a studiat biochimia mecanismului de inductie a expresiei genei c-fos, constatându-se ca acesta depinde de stadiul activitatii de diferentiere si proliferare celulara. Agentii care depolarizeaza neuronii induc c-fos pe calea deschiderii canalelor de Ca2+. Se conclude ca, inducerea c-fos se realizeaza nu numai pe calea interactiunii “receptor-ligand” ci si cu agenti depolarizatori sau prin interactiuni care influenteaza canalele pentru Ca2+ (29).
Virusurile sau unele proteine ale acestora, au capacitatea de a transactiva expresia genelor celulare endogene legate de procesul de proliferare celulara. Proteina p40tax a virusului HTLV-I determina expresia protooncogenei c-fos care codifica sinteza proteinei c-Fos, în contrast cu nivelul neschimbat al mRNA altor gene cum sunt c-myc, c-myb si c-jun.P40tax joaca un rol important în transformarea limfocitelor T.
Produsul genei BZLF-1 din EBV numit ZEBRA este o proteina ce cupleaza la DNA si este partial omoloaga cu c-fos, la rândul ei cuplând specific la siturile AP-1; aceasta proteina poate induce ciclul litic al limfocitelor B infectate latent. ZEBRA poate induce astfel, expresia
c-fos prin siturile AP-1-like prezente în promotorul genei c-fos.
Inducerea transcrierii c-fos începe dupa o ora de la infectarea cu VSH-2 si atinge maximum dupa 3 ore, iar dupa 24 ore se opreste complet. Inducerea c-fos în celulele L929 determina aparitia a doua transcripte nucleotide, iar în celulele W138 (celule umane diploide), numai un transcript.Pentru inducerea c-fos este obligatorie sinteza proteinelor virale (30, 31, 32).
Expresia protooncogenei c-fos apare si în procesul cresterii dupa 30-40 minute, si dupa 4 ore posthepatectomie. Gena c-myc se exprima timp de o ora si apoi dupa 6-8 ore. Se subliniaza expresia diferentiata a genelor studiate în fazele prereplicative ale hepatocitelor (33). Astfel, gena c-fos este indusa tranzitoriu în diferite linii celulare în cultura, de catre numerosi stimuli celulari, totusi, unii autori sustin ca gena c-fos este constitutiv transcrisa în diverse celule printre care si cele limfoide (34).
În procesul formarii encefalului la sobolan, s-a demonstrat ca în perioada de dezvoltare rapida a embrionului si pâna la a 16-a zi postnatal mRNA c-fos are un nivel foarte scazut. Se apreciaza ca gena c-fos nu participa la reglarea mitozei în perioada postnatala timpurie, pentru ca ulterior sa joace un rol important în dezvoltarea functionala a tesutului nervos cerebral (35).
În ultimul timp s-a acordat o mare atentie genei c-fos si expresiei ei în celula nervoasa. Expunerea la un mediu conditionat anterior cu amfetamina (1mg/Kg i.p.) induce expresia c-fos în cortexul frontal, expresie considerata un marker pentru activitatea neuronilor. Administrarea acuta si repetata a amfetaminei induce expresia aditionala a c-fos si în nucleul accumbens (36).
Injectarea subcutana a formalinei (50 micromoli, 10%) la sobolani masculi creste activitatea c-fos în gyrus dentatus (DG1 si câmpurile CA3), iar la femele, nivelele c-fos sunt mai scazute în câmpurile hipocamapale (37).
Injectarea formalinei diluate în peretele colonului reduce expresia fos în neuronii mienterici si în glia enterica, în neuronii maduvei spinarii si în cei din trunchiul cerebral, ceea ce s-ar datora stimularii chimice directe a colonului si/sau colitelor acute ulceroase (38).
Proteina c-Fos se modifica în maduva spinarii de la sobolanii carora li s-a grefat adenocarcinomul de prostata- MAT-Ly Lu- în membrele posterioare. Marcajul cel mai dens al fos apare în segmentul L3-L5, pe aceeasi parte a membrului grefat. Marcajul detectat la 5 zile creste pâna la 10 zile si apoi scade. Coarnele ventrale ale maduvei sunt cel mai dens marcate. Se demonstreaza ca semnalele sunt transmise de tumora spre sistemul nervos central inclusiv maduva spinarii care reflecta o stare de durere (39).

Fos în AP-1

Genele fos si jun codifica proteine nucleare care participa la reglarea transcrierii altor gene. c-Fos si c-Jun formeaza complexe proteinice care interactioneaza specific cu elemetul reglator de legare via cunoscutului complex AP-1. Desi jun se poate cupla la DNA în absenta lui fos, prezenta acesteia mareste viteza de cuplare pe baza stabilizarii complexului DNA-proteina. Pentru formarea complexului fos-jun raspund 7 resturi de leucina. Cele doua proteine Fos si Jun formeaza heterodimeri care se leaga cu mai înalta eficienta la promotorul genelor ce detin situsul AP-1. Proteina Fos actioneaza în sensul reglarii transcriptionale, prin domeniile de la capatul
C-terminal (40, 41).
AP-1, complex constituit din p-c-Jun si p-c-Fos regleaza transcrierea promotorilor ce contin elemente de cuplare activatoare de tip AP-1-like. C-Jun are activitate de legare a DNA, iar c-Fos este omoloaga în domeniul de legare a DNA cu c-Jun. In vitro, c-Jun se leaga la DNA ca homodimer la situl AP-1, pe când c-fos nu poate dimeriza si nu detine afinitate pentru elementul AP-1. Proteinele translatate c-Jun si c-Fos se leaga la DNA AP-1, de 250 ori mai eficient ca heterodimeri, decât o fac cu homodimerii c-Jun. Astfel, c-jun cupleaza la DNA ca dimer, iar la
c-fos, în calitate de partener natural. În hiperexpresia proteinei c-Jun în absenta c-Fos, se pot produce homodimeri aberanti ai complexelor transcriptoare, care pot altera mecanismele normale de control ale expresiei genelor (42).

Transformarea prin proteinele Fos

Transformarea prin proteina c-Fos poate fi realizata daca este alterat domeniul codificat pentru cuplare COOH-terminal. Când transcrierea genei c-fos este indusa cu diversi agenti într-o varietate de tipuri celulare, proteina c-Fos este sintetizata tranzitoriu. Pentru transformarea celulara este obligatorie o sustinuta sinteza a proteinei c-Fos.
Datorita deletiei a 104 pb în timpul biogenezei v-fos, proteina v-Fos are un COOH-terminal alterat, asa încât ea se va sintetiza constitutiv, inducând transformarea. Astfel, p55fos elaborata de FBJ-MSV cât si p75gag-fos elaborata de FBR-MSV induc transformarea morfologica mai pronuntata în ultimul caz. Desi p75gag-fos este o proteina de fuziune, componenta gag nu pare sa influenteze abilitatea transformanta a proteinei (20). Virusul himeric FBR caruia i s-a deletat gena gag pastreaza un înalt potential transformant caracteristic, astfel ca gena gag nu participa la elaborarea proteinei transformante (43).
Proteinele c-Fos sunt de 4-5 ori mai fosforilate decât proteinele v-Fos. Ambele detin câteva fosfopeptide generale, dar proteina c-Fos contine si unele importante fosfopeptide unice, care însa lipsesc din proteina v-Fos. Aceste situri unice ale fosforilarii c-Fos sunt localizate la capetele COOH (ultimii 20 aminoacizi). Fosforilarea proteinei c-Fos si nu a proteinei v-Fos este stimulata de 5 ori in vivo când celulele sunt tratate cu ester forbol. Nivelul fosforilarii c-Fos este independent de PKC (20).
Lezarea DNA este o manifestare centrala a carcinogenezei. Agentul care lizeaza DNA activeaza un numar de cai de transductie a semnalelor ce duc la repararea DNA, apoptoza sau la amplificarea ciclului celular. O celula cu DNA deficient reparat este mai expusa la mutatii care promoteaza cancerul. FBR-v-fos, omologul retroviral al protooncogenei c-fos inhiba raspunsul celulei la radiatii. Celulele care exprima acest omolog retroviral au abilitate redusa în ce priveste repararea DNA lezat de radiatii, astfel încât ele supravietiesc putin postiradiere. În plus,FBR-v-fos inhiba PK dependenta de DNA, o kinaza specifica activata dupa expunerea celulelor la radiatii. Aceste efecte sunt specifice pentru radiatiile ionozante, dar nu si pentru cele ultraviolete; efectele sunt dependente de modificarea unui lipid reclamat pentru tumorogeneza indusa de FBR-v-fos miristilata. O mutanta nemiristilata nu are efect. Oncogena retrovirala poate conduce la instabilitate genica crescuta, ceea ce amplifica potentialul oncogenic al celulei.
FBR-v-fos inhiba multiple diferite cai de diferentiere; in vitro inhiba cresterea si diferentierea terminala a adipocitelor si activitatea proteinei c/EBP alpha , un reglator cheie al acestei diferentieri, reglator care se poate implica în generarea liposarcoamelor (44, 45).
FBJ-virusul sarcomului murin poarta v-fos si induce osteosarcomul. Expunerea soarecilor transgenici la nivele înalte de c-fos conduce la aparitia postnatala a tumorilor osoase, respectiv cartilaginoase.
În primordiile prezumtive ale picioarelor embrionului de pui aflat în stadiul 10 s-a indus ectopic oncogena fos, prin microinjectarea retrovirusului competent de replicare. Consecinta a fost trunchierea cartilajelor tuturor oaselor lungi, cu condrodisplazie datorata retardarii severe a diferentierii condrocitelor proliferative în condrocite mature sau hipertrofiate, ca si o usoara întârziere a condensarii precartilaginoase.
Expresia genelor tuturor membrilor cunoscuti ai AP-1 de la pui ce includ si genele transformante c-jun si fra-2 nu induc totusi anomalii macroscopice în formarea membrelor sugerând ca o fractie specifica a proteinei Fos intervine în diferentierea osului embrionar endocondral. Extinderea trunchierii este mai marcata în cazul v-fos decât al c-fos. Se releva ca activitatea transformanta a proteinei Fos este necesara pentru inducerea displaziei, sugerându-se faptul ca mecanismele moleculare comune sunt implicate atât în condrodisplazia embrionara cât si în formarea tumorilor oasoae (46).
Celulele osoase sunt o prima tinta pentru functia biologica a complexului factorilor de transcriere fos/jun (AP-1). Expresia dereglata a c-fos sau v-fos în celulele osoase induce tumorogenitate si deci aparitia osteosarcomului non-metastazic. Din contra, oncogena v-fos transforma fibroblastele într-un fenotip invaziv însotit de expresia divereselor gene asociate invaziei si metastazarii. Activitatea sustinuta a AP-1 se pare ca nu este suficienta pentru inductia în celulele osoase transformate a genelor asociate invaziei si metastazarii dependente de complexul AP-1. S-au identificat promotorii genei colagenazei I si a stromelizin-1, ca mijloace utile pentru analiza altor factori care regleaza progresia metastazarii osteomului (47).
Fibroblastele transformate de oncogenele v-fos arata expresia crescuta a unui numar de gene implicate în invazia celulelor tumorale si în metastaza. În contrast cu fibroblastele normale de sobolan-208F-, celulele transformate de fos sunt independente de factorul de crestere pentru invazie. Invazia celulelor transformate de v-fos sau EGF reclama activitatea AP-1 si este inhibata de oligonucleotide antisens c-Jun si de expresia unei mutatii negative dominante c-jun -TAM-67-.Invazia indusa de EGF este inhibata de oligonucleotidele antisens c-Fos si c-Jun. Se avanseaza ipoteza ca rolul AP-1 în transformare este de a activa programul invaziei multigenice (48).

Gena fra-2

Gena fra-2 este înrudita cu protooncogenea c-fos codificând un membru al familiei fos, element component al factorului de transcriere AP-1. Fra-2 este o gena distincta de alte gene fos deoarece are un rol unic în diferentierea celulara din perioada fetala. Ea este activa în organogeneza târzie, fapt demonstrat imunohistochimic. Transcriptele fra-2 sunt prezente în câteva epitelii diferentiate, în cartilaje si în sistemul nervos în dezvoltare.
În a 16-a zi de dezvoltare embrionara, fra-2 este detectata în straturile bazal si granulos ale epidermei, dar nu în cele cornificate. În a 17-a zi este detectata, de asemenea, în cartilaje dar si în oasele în dezvoltare. Nivele înalte se exprima si în tesutul cromafin din medulosuprarenala, în cortexul embrionar dar si în creierul matur la nivelul putamenului, hipotalamusului si hipocampului (49).

c-jun and c-fos protooncogenes

Ap-1 was originally identified as a TPA-inducible DNA-binding factor that stimulated transcription of the simian virus 40 (SV40) enhancer. Purification of the ywo major proteins present in AP-1 revealed to be encoded by two different proto-oncogenes: c-jun, the cellular homologue of v-jun oncogene of ASV 17 (aviansarcoma virus 17), and c-fos, the homologue of v-fos oncogene of FBJ (Finkel-Biskis-Jinkis) murine osteosarcoma virus. Both c-jun and c-fos can be activated as transforming genes by overexpression of normal genes.They can be rapidly induced in a large number of different cell types by a variety of factors, including growth factors and are immediate early response genes.
Like other nuclear oncogenes, there are multiple jun and fos- related genes, jun-B and jun-D from the jun familiy and the fra-2 gene related to c-fos, the latter being involved in cell differentiation during development. All these genes encode proteins that are capable of dimerization and have a specific sequence for DNA binding.
Structural analysis of c-jun encoded protein,which is 340 amino acids, revealed that is C-terminal end contains a leucine zipper motif (for dimerization), a bosic region (for DNA binding) and trnsactiivation domain. The N-terminal and of the protein contains a regulatory domain which is absent in v-jun encoded protein . Phosphorylation of N-terminal region is associated with increased DNA binding and transcriptional activity. The jun proteins can form homodimers which are transcriptional activators or can associate with c-fos proteins to form heterodimers which are less eficient as transcriptional activators. The c-jun proteins can act whithin the AP-1 complex and as well as independently in influencing the expression of other genes.
C-fos protein, which is 381 amino acids, is similar but not identical, to that of c-jun protein in that it contains the basic region and zipper motif that is differently located in the protein structure. Unlike c-jun proteins,c-fos encoded proteins are unable to form stable homodimers.
The Jun and Fos proteins form heterodimers with other transcription factors related proteins of CREB family (c-AMP responsive element binding factors). C-jun and c-fos expression is differently influenced by other protooncogenes encoded proteins such as Ras, Raf and Src.
Transformant activity of v-jun and c-jun has been demonstrated in a variety of cell types. Fibroblasts transformed by v-jun are able to divide more rapidly than their normal partners and are dependent on growth factors. C-jun mRNA expression is negative regulated in cells transformed by v-jun.
Transformation by c-fos depends on a sustained synthesis of the protein and on the presence of an altered binding domain. C-fos proteins are 4-5 fold more phosphorylated than v-fos proteins. V-fos proteins are able to inhibit diveerse differentiation pathways, are involved in carciniogenesis of liposarcoma and osteosarcoma. Fibroblasts transformed by v-fos show a increased expression of genes involved in invasion and metastasis of tumoral cells.

GENELE FAMILIEI ETS
(Eritroblastoza)

Genele ets codifica factori de transcriere care recunosc secventele GGAA prezente în variate elemente promotor/enhancer celulare si virale, activând transcrierea pe calea cuplarii la aceste secvente. Genele ets sunt implicate în reglarea dezvoltarii si se exprima într-o varietate de celule inclusiv hematopoietice.
La pui, gena ets-1 se exprima prin proteina p54c-ets-1 si prin proteina p68c-ets-1, proteine care difera în capatul N-terminal datorita procesarii alternative. P-68c-ets-1 se exprima în celulele endoteliale ale vaselor de sânge în formare, iar p54c-ets-1 se exprima în celulele hematopoietice. Prin proteinele sale, gena ets-1 actioneaza asupra altor numeroase gene care contin situsul de cuplare ets (EBS-Ets-Binding Site).
Virusul leucemiei acute aviene- E26- determina la pui, mielo- si eritroblastoza . Genomul lui contine gena de fuziune tripartita -gag-myb-ets-, care codifica o fosfoproteina nucleara - p135gag-myb-ets. S-a stabilit ca leucemogenicitatea mieloida se datoreaza prezentei genei myb, iar cea eritroida, prezentei genei v-ets.. De aici sugestia ca, proteinele ets sunt importante în hematopoieza, îndeosebi în eritropoieza, dar si în procesul metastazarii (50).
Gena ets-1 umana este localizata lânga o regiune break-point pe cromosomul 11q23 si a fost detectata în unele leucemii acute limfoide si mieloide. Promotorul ei nu contine secventa TATA, dar contine, în schimb, în intima asociere, multiple situri de initiere a transcrierii. Promotorul genei detine câte un loc de cuplare pentru AP-1 si AP-2 si în plus 5 locuri prezumtive de cuplare pentru Sp1. De asemenea, promotorul ei contine si un loc de cuplare pentru proteina Ets-1, ceea ce indica existenta unui mecanism autoreglator pentru expresia genei. Proteinele
AP-1, AP-2 si c-Jun au astfel efect reglator asupra activitatii genei ets-1 (51).
În timpul morfogenezei penelor de pui, s-a demonstrat ca c-ets-1 este un factor transcriptional nuclear care se exprima în derm. Sunt elaborate cele doua proteine p54 si p68, iar dupa tratamentul cu hidrocortizon expresia p68 creste, iar a p54 scade. În timpul morfogenezei penelor, celulele dermale migreaza de-a lungul pachetelor de fibre de colagen, pentru a coloniza ariile unde se formeaza primordiul penei. Embrionii de pui tratati cu hidrocortizon în timpul fazei critice a rearanjarilor dermale, expun arii tegumentare aproape lipsite de penaj, arii în care dermul prezinta cantitati crescute de colegen interstitial.
Deoarece ets-1 regleaza gena metaloproteinazei matriciale, s-a analizat expresia colagenazei tip IV (de 72kD) în embrionii tratati cu hidrocortizon si în embrionii martori. Astfel, s-a demonstrat ca expresia mRNA al colagenazei, scade în dermul puilor tratati, dar se coreleaza cu expresia p54c-ets-1. În acest mod, hidrocortizonul moduleaza expresia c-ets-1 care astfel poate fi implicat într-un model alterat al dezvoltarii penei, dezvoltare mediata de acumularea colagenului prin scaderea activitatii colagenazei (52).
Asa cum s-a mentionat, membrii familiei genei ets se exprima în tesutul hematopoietic, implicându-se astfel în evolutia normala a acestui tesut. In vitro, s-a demonstrat ca ets-1 contribuie la dezvoltarea fenotipului eritroid. Ca raspuns la tratamentul cu hemin si/sau cytosin arabinofuranosid (Ara-c), liniile pluripotente eritroleucemice HEL si K562 exprima mesaje pentru un numar de gene ets, dar numai nivelele de ets-1 sunt crescute. Astfel tratamentul mentionat induce diferentierea eritroida. Pe de alta parte, oligonucleotidele antisens Ets-1 inhiba hemoglobinizarea celulelor tratate.În contrast, infectia cu virusul care contine ets-2 nu determina modificari detectabile în procesul proliferarii sau în caracterul eritroid al celor doua linii celulare. Deci, ets-1 intervine important în diferentierea eritroida (53).
Familia factorilor de transcriere ETS controleaza un mare numar de gene din celulele hematopoietice. Astfel, s-a urmarit la soareci evolutia unor linii de limfocite aflate în stadiile timpurii ale specificitatii lor. Paralel, s-a urmarit populatia de celule distinct primare, reprezentând stadii de dezvoltare a limfocitelor T si B, a precursorilor limfoizi pluripotenti, a celulelor NK mature si a celor mieloide. Celulele au fost monitorizate pentru expresia mRNA a genelor erg, ets-1, ets-2, fli-1, elf, gabp.alpha, pu.1 si spi-B.Stadiile cele mai timpurii ale diferentierii limfocitelor arata o particularitate dinamica a reglarii genelor acestei familii, cu tranzitii acute în exprimarea corelata cu evenimentele stoparii în unele faze ale dezvoltarii. ets-1, spi-B si pu.1 sunt exprimate în aceste stadii, dar nu în limfocitele T târzii. Gena erg este indusa în timpul specificitatii liniei T si ulterior este silentioasa permanent. Gena spi-B este hiperreglata tranzitoriu, dupa care devine silentioasa în acelasi stadiu ca al genei erg. Gena pu.1 represeaza marcat linia limfocitelor T ajunsa la un anume grad de dezvoltare, dar este factor de reglare pentru genele celulelor B si mieloide. Astfel, setul factorilor ETS mobilizat în timpul specificitatii liniei T este diferit de cel care mentine expresia genelor în timpul selectiei timocitelor, ca si în toate clasele de limfocite T mature (54).
Pentru elucidarea reglarii transcriptionale si a remodelarii endometrului uman în timpul diferitelor stadii ale ciclului menstrual, s-au analizat 3 membri ai familiei ETS: astfel elf-1 predomina în epiteliul glandular, în timp ce ets-1 si ets-2 au activitate redusa atât în acesta cât si în celulele stromale. În timpul fazei menstruale a ciclului, expresia este scazuta, dar în celulele deciduale ale fazei secretorii târzii sunt comune activarile ets-1, ets-2 si elf-1; aceste aspecte se confirma si în celulele în cultura ale stromei endometriale. Celulele endoteliale diferentiaza si diverse izoforme si produse de fosforilare ale genelor ets-1 si ets-2 din cele doua tipuri celulare. Deoarece elf-1 predomina în celulele glandulare , se presupune ca gena are un rol unic în reglarea specifica a epiteliului endometrului (55).
La pacientii infectati cu HIV-1, s-a descoperit faptul ca situsul 5’LTR HIV-1 se cupleaza la NF-kappaB, ceea ce presupune ca acest situs detine potential de legare cu mai multi factori de transcriere, printre care, posibil, si GABP-alpha si GABP-beta ambii fiind membri ai familiei factorilor de transcriere Ets (56).

Gena ets-2

Gena ets-2 este membru al familiei ets având aminoacizii proteinei pe care o codifica, similari cu v-ets a virusului E26. Gena detine 10 exoni din care 9 participa la codificarea celor 49 aminoacizi ai proteinei Ets-2. Ea directioneaza sinteza a 3 transcripte RNA care difera prin lungimea capetelor 3’. Heterogenitatea dimensiunilor transcriptelor se datoreaza, probabil, utilizarii a 3 diferite locuri de semnale de poliadenilare (57).
Gena umana ets-2 este deci un omolog al genei v-ets care codifica o proteina nucleara de 56kD (p56). Promotorul genei ets-2 detine un loc de cuplare Sp1 si unul GC-elementul proximal al sitului de initiere. În plus, detine si un situs deosebit de lung (de 250 p.b) necesar transcrierii ets-2, care poate servi ca activator al transcrierii (58).
P56 kD umana este o fosfoproteina cu perioada de înjumatatire de 20 minute. Tetradecanoil forbol acetat (TFA) declanseaza cresterea de 5-20 ori a nivelului proteinei Ets-2 în liniile celulare umane, nivel probabil reglat de PKC, direct sau indirect via mecanismelor de post-translatie (59).
Anticorpii monoclonali specifici pentru ets-2 uman, preparati din soareci imunizati recunosc doua proteine umane modificate de ets: p56 si p54, dar nu reactioneaza cu proteinele de pui, sobolan, soareci, bovine sau maimuta. În schimb, recunosc numai epitopi specifici ai proteinei umane Ets 2, 3 , epitopi distincti din cei 8 ai pEts-2 (60).
S-a detectat si caracterizat un nou element reglator cu activitate de promotor în intronul 1 c-ets-2, care induce expresia acestui transcript divergent în 5’, prin multiple situri start dispersate în interiorul a 300 p.b. Printre acestea, 3 reprezinta puncte de initiere transcriptionala majora. În diverse linii celulare, precum COLO 320, NBE sau HepG2 s-au detectat transcripte initiate de acest nou promotor, care releva situri putative de legare pentru factorii Ets, Myb, GATA si Oct. La pui, acest promotor este conservat functional (61).
Gena ets-2 poate fi o tinta nucleara a genei ras în liniile celulare tumorale ovariene si pe calea de semnalizare ras, se poate activa în cancerul ovarian, printr-un mecanism independent de alterarea genetica a ras (62).

Alte gene ale familiei ets

Din familia genelor ets, gene nucleare cu capacitate de initiere a transcrierii, se cunosc urmatoarele: erg, elk-1, elk-2, fli-1, etv, pu.1 si spi-B. Gena erg este înrudita cu proteina Ets si expresia ei poate fi urmarita în timpul dezvoltarii embrionare timpurii. Erg XI codifica cel putin doua proteine rezultate în urma splicingului alternativ. Când este exprimata ectopic prin microinjectii de mRNA sintetic, în procesul dezvoltarii lui Xenopus apar multiple defectiuni. Se admite ca gena erg s-ar implica si în motilitatea celulelor, ca si în dezvoltarea sistemului circulator (63).
GATA-1 este un factor de transcriere specific liniei eritroide.; promotorul acestei gene, care poate fi activat de virusul E26 de la pui contine multiple situri de cuplare ets (EBS-Ets-Binding Site). Analiza EBS demonstreaza ca acest promotor este o tinta pentru cuplarea si activarea de catre membrii familiei genelor ets. Gena gata-1 îsi poate autoregla expresia, dar regleaza, în timpul eritropoiezei normale si leucemice, transcrierea unui numar de gene înrudite. În sistemul murin ea este reglata de expresia proteinei p135gag-myb-ets.. EBS de la pui s-a detectat în promotorul genei stromelizin cu care are identitate în secventele miez ets (50).
Gena pu.1 codifica un factor de transcriere din familia ets, care controleaza expresia multor gene specifice celulelor B, macrofagelor si expresiei critice pentru dezvoltarea liniilor limfocitara si mielocitara. Ca asa stau lucrurile o dovedeste faptul ca, soareci deficienti în gena pu.1 au defecte în evolutia acestor linii celulare.
Gena pu.1 este identica cu gena spi-1 izolata din siturile de integrare provirala (virus Friend) comune în eritroleucemia murina MEL (MurinEritroLeucemia) indusa de acest virus; se apreciaza ca expresia dereglata a genei este o treapta esentiala a bolii. Pe de alta parte, se sutine ca hiperexpresia genei pu.1 + DMSO induce oprirea marcata a cresterii si apoptozei celulelor MEL, de unde ideia ca unele oncogene, în conditii specifice, induc inhibarea acestor procese, mai curând decât proliferarea si transformarea celulelor. S-a descris rolul PU.1 în diferentierea, proliferarea si apoptoza celulelor hematopoietice, ca si un probabil mecanism molecular al efectelor induse de aceasta în celulele MEL (64).
Sarcomul Ewing este cel mai diferentiat membru al familiei tumorilor primitive neuroectodermale periferice. Translocatia cromosomiala care implica gena ews si alte 5 gene ale factorilor de transcriere ai familiei ets, creiaza gene de fuziune ce codifica factori de transcriere aberanti, implicati într-o vasta majoritate de sarcoame Ewing. Astfel, factorii de transcriere himerici rezulta din fuziunea NH2-terminal a genei ews cu COOH-terminal al uneia din cele 5 gene ets. Majoritatea tumorilor exprima fuziunea ews/fli-1, dar unele exprima variate himere precum ews/etv-1.
Injectarea în soareci SCID a celulelor NIH3T3 care exprima fuziunile de gene mentionate, conduce la aparitia mai rapida a tumorilor care, în plus sunt si mai voluminoase decât celulele de control . Potentialul tumorogenic al fiecarei fuziuni ews/ets este legat de structura C-terminal. C-terminal FLI-1 confera un potential tumorogenic mai înalt decât o face domeniul ETV-1 corespunzator. Tumorile rezultate în urma fuziunilor ews/fli-1 si ews-etv-1 releva aspecte macro- si microscopice asemanatoare, însa difera de cele provenite din celulele NIH3T3 activate de gena ras. Astfel, în ciuda diferentelor structurale, respectivele fuziuni promoteaza oncogeneza via cailor biologice similare (65, 66).
La soareci, s-a caracterizat o noua gena ets divergenta- gena ehf- (Ets Homologous Factor) care carteaza la 11p12 si are deletii în numeroase carcinoame de prostata, mamare si pulmonare, dar si o “ pata fierbinte” cu amplificare sau deletie ereditara. Proteina Ehf represeaza activitatea indusa de ets-2 a promotorilor stromelisinei-1 si colagenazei-1. Se sugereaza ca aceasta ar contribui la dezvoltarea organismului uman si carcinigenezei acestuia, candidând la statutul de gena supresoare de tumori (67).
Proteina E1af apartine familiei factorilor de transcriere ETS si este implicata în reglarea expresiei genei metastazarii. Într-un sarcom nediferentiat de la un copil, s-a stabilit ca o parte din gena ar putea fuziona prin translocatie cu gena ews. Gena umana e1af este localizata în regiunea q21 a cromosomului 17, fiind organizata în 13 exoni distribuiti de-a lungul a 19kb din DNA genomic. Regiunile netranslatate 3’ si 5’ ale genei sunt de 0,7 si respectiv 0,3kb (68).
În evolutia limfocitelor, expresia genelor Ig este strict reglata în functie de timp si în maniera tesut-specifica. În controlul legarii V (kappa)-J (kappa) poate fi implicata o noua familie de proteine, alta decât PU-1. Astfel, s-a identificat factorul PRF, înrudit cu PU-1. Aceasta noua proteina interactioneaza cu secvente care cupleaza PU.1 si în variati promotori si enhanceri, inclusiv kappa E3.
Expresia genei prf predomina în precursorii liniei B, dar nu în limfocitele mature. Neavând functie de activare transcriptionala, proteina Prf poate actiona ca un antagonist al celorlalte proteine ale familiei ETS cum sunt Pu.1 si Spi-B (69).
Gena tie-2 codifica un receptor TK specific celulelor endoteliale, receptor reclamat pentru dezvoltarea normala si hiperreglat în timpul angiogenezei. Promotorul genei detine locuri de cuplare înalt conservate pentru factori de transcriere ETS. Astfel un nou asemenea factor Ets- Nerf-2 se exprima în celulele endoteliale si poate transactiva puternic regiunea reglatoare a genei tie-2, comparativ cu ceilalti factori ETS care au efect stimulator redus sau chiar absent. În concluzie, factorul Ets-Nerf-2 poate regla expresia genei vascular-specifice tie-2, ca factor de transcriere critic (70).

Factorii care influenteaza genele ets.

Citokinele si factorii de crestere s-au dovedit a fi cei mai puternici stimulatori ai expresiei genelor familiei ETS. Astfel sunt considerati TNF-alpha si IL-1-alpha pentru gena c-ets-1 pe care o induce într-o ora sustinându-I timp de 19 ore productia de mRNA si de proteina c-Ets-1. Din contra, bTGF, EGF si PDGF sunt stimulatori tardivi initiind activitatea genei dupa 19 ore. Acesti factori de crestere, potenteaza însa inductia c-Ets-1 prin TNF-alpha, în timp ce TNF-beta este inefectiv.
Folosind inhibitori ai transcrierii si translatiei s-a demonstrat cresterea mRNA c-Ets-1 via TNF-alpha, rezultata din noua transcriere mai curând decât din stabilizarea produselor sintetizate. Deci, c-ets-1 este o tinta nucleara pentru numerosi factori de crestere, functionând ca o gena de raspuns timpuriu pentru TNF-alpha (71).
Tetradecanoil forbol acetat (TFA) declanseaza cresterea de 5-20 ori a nivelului proteinei Ets-2 în linii celulare umane. Un efect similar are si oleil acetil glicerina, care este un activator al PKC. Ciclohexamida amplifica efectul TFA (59).
Activarea mitogenica a genei ras induce pe calea PK, fosforilarea lui Ets-2 la pozitia treoninei 72. Astfel, în liniile de celule tumorale ovariene, gena ets-2 este o tinta nucleara a actiunii ras (62).

Tintele genei ets.

Proteinele Ets cu functia principala de transactivare, actioneaza asupra unor gene carora le declanseaza activitatea. Deoarece activeaza si gene cu rol în diviziunea celulara sunt considerate, în primul rând, ca proteine cu functii mitogenice.
Se sugereaza ca gena ets ar avea un rol esential în activarea genei TNF. Cotransfectia plasmidei c-ets sau expresia jun cu constructele reporter promotor TNF-CAT, releva participarea ambilor factori în reglarea transcrierii genei TNF. Mutatiile specifice în siturile ets sau jun conduc la pierderea completa a responsabilitatii factorilor de transcriere asupra genei TNF (72).
Factorul de transcriere Ets regleaza o activitate enhanceriala în al 3-lea intron al genei TNF-alpha. În acest intron s-a stabilit prezenta unui construct reporter ce contine regiunea flancata 5’ din gena TNF-alpha de la soareci, si care se manifesta slab când este transfectat în celulele macrofage-like RAW-2647. Adausul la acest construct a intronului 3 al TNF-alpha duce la amplificarea proteinei CAT, proces anulat însa, prin îndepartarea unei secvente conservate de 20 p.b. din intron, sau daca este cotransfectat cu gena reporter un factor de cuplare Ets dominant negativ. Mutatiile în acest situs distrug locurile potentiale ale factorului de transcriere Ets, reducând astfel activitatea transcriptionala. În celulele RAW-2647, Ets ar avea rol de factor de transcriere pentru productia de TNF-alpha (73).
IL-5 exprimat primar în limfocitele Th2 joaca un rol important în aparitia bolilor alergice cum este si astmul alergic. Reglarea expresiei genei IL-5 de catre factorii de transcriere Ets-1 si Ets-2, dar nu de Ecf-1 se produce prin activarea promotorului IL-5 uman în celulele T Jurkat, reclamând fie PMA (Phorbol 12 Miristat Acetat) plus ionomicina, fie PMA plus proteina virala Tax-1. Proteinele Ets-1 si Ets-2 îsi exercita efectele pe promotorul IL-5 via motifului GGAA din elementul cle 0. Se demonstreaza în premiera ca Ets-1 si Ets-2 pot coopera cu GATA-3, ionomicina si Tax-1 pentru cresterea efectului si în prezenta PMA. Sinergismul GATA-3, fie cu Ets-1 fie cu Ets-2 poate juca un rol important în reglarea expresiei IL-5 în celulele Th2 dependente de calciu sau de Tax-1, sau în limfocitele T leucemice (74).
În timpul repararii tesutului hepatic, celulele stromale stelate (HSC), pericite-like, trec din starea inactiva, în celule asemanatoare miofibroblastelor sintetizatoare ale matricei extracelulare. În izolatele de HSC proaspete sau activate, s-a detectat factorul de transcriere Ets-1, ca si mari cantitati de mRNA ale acestuia. Transcriptele specifice Ets-1 sunt prezente si în celulele parenchimale, dar si în cele stelate demonstrând faptul ca expresia hepatica a Ets-1 nu este specifica sau stricta pentru HSC. Implicatiile factorului Ets-1 în modelarea diferitelor celule ale tesutului hepatic sugereaza ca acesta ar putea fi de importanta cruciala pentru activarea celulelor stelate în procesul repararii tesutului hepatic (75).
Gena ets-1 regleaza transcrierea multor altor gene care codifica proteinele matricei extracelulare, respectiv osteopontin si tenascin, precum si enzimele implicate în degradarea si remodelarea acesteia, cum sunt stromelisin si UPA ( Urokinase plasminogen Activator) (76).
Tenasacin-c (Tn-c) este o glicoproteina a matricei extracelulare care se exprima pregnant în timpul dezvoltarii, dar la nivele scazute în tesuturile adulte normale. Nu se exprima însa, în timpul vindecarii ranilor, bolilor fibrotice sau cancerului. S-a experimentat reglarea promotorului uman Tn-c, în fibroblaste pentru stabilirea mecanismelor ce controleaza expresaia genei Tn-c, constatându-se prezenta unui scurt segment în promotorul sau, cuprins între perechile de baze -133 si -27, care detin 3 locuri de cuplaere EBS conservate în evolutie, locuri la care, in vitro, cupleaza proteina Fli-1 ce mediaza transcrierea genei Tn-c. De asemenea, doua EBS proximale contribuie semnificativ la activitatea bazala a promotorului acestei gene.GABP prezent în extractele nucleare de fibroblaste, interactioneaza cu cele doua EBS proximale. Câteva locuri de cuplare Sp1 si Sp3 din regiunea promotoriala sunt în intima proximitate cu EBS. Studiile pe Drosophila demonstreaza ca fie Fli-1 fie GABP-alpha+beta, interactioneaza functional cu Sp1 rezultând stimularea sinergica a activitatii promotorului tenasacin-c, glicoproteina matricei extracelulare. Deci, pentru prima data se afirma ca gena tn-c este reglata de proteine Ets, care cu concursul sitului Sp1 activeaza expresia Tn-c (77).
În timpul morfogenezei glandei mamare s-a observat expresia factorului transcriptional c-Ets, ca si una din tintele acestuia - gena upa- în celulele mezenchimale aflate în stadiul timpuriu al invaziei epiteliale, iar mai târziu, în însasi celulele epiteliale. Studiile in vitro au aratat ca mRNA ambelor gene (c-ets si upa) poate fi indus în culturi de celule epiteliale mamare normale, ca raspuns la conditiile de mediu pentru fibroblaste.
Liniile celulare tumorogene invazive din epiteliul glandular mamar exprima constitutiv c-Ets-1 si Upa, în timp ce liniile ne4invazive, nu. În coculturile tridimensionale în gel colagen, expresia preferentiala a genei c-ets este detectata în celulele epiteliale migrate prin gel, dar si în celulele canceroase diseminate. Expresia celor doua gene se coreleaza cu invazivitatea celulelor (78).
Factorul de transcriere c-Ets-1 este implicat si în transactivarrea genelor proteazelor de degradare a matricei extracelulare, de unde ssugestia ca ar interveni important în invazia tumorala. Analiza expresiei genelor ets-1, colagenazei-1 si upa în numeroase tipuri de carcinoame releva ca în celulele canceroase (mai frecvent în cele neuroendocrine) sunt prezente transcriptele c-ets-1, comparativ cu alte carcinoame. iar în stadiile III si IV si în metastaze mai frecvent decât în stadiile I si II.
Gena colagenazei-1 se exprima în 16/34 tumori neneuroendocrine si în 1/20 tumori neuroendocrine, fie în celulele stromale (12/17) fie în cele canceroase (6/17). mRNA Upa s-a exprimat în celulele canceroase si/sau stromale în 45/54 carcinoame pulmonare. Astfel, cei 3 factori de transcriere sunt implicati în invazia cancerului pulmonar sugerându-se ca proteina c-Ets-1 poate transactiva gena colagenazei-1 în timpul invaziei tumorale (79).
Inhibitorul tisular al metaloproteinazei-1(TIMP-1) degradeaza matricea extracelulara, elementul responsabil de controlul expresiei genei timp-1 fiind un situs selectiv de legare pentru proteinele c-Fos si c-Jun. Adiacent acestuia este si un loc de cuplare pentru proteinele Ets. Desi c-Ets-1 singur nu activeaza transcrierea de la TIMP-1, ea creste totusi sinergic transcrierea cu AP-1. Se sugereaza ca AP-1 leaga c-Ets-1 la promotorul TIMP-1, prin interactiunea prolina-proteina în vederea exercitarii reglarii transcriptionale dependenta de Ets. În concluzie, expresia TIMP-1 este controlata de mai multe elemente transcriptionale Ets-1 si AP-1 (80).
Reglarea genei leucocitelor -integrin CD11c- care codifica o proteina de 150,95kD, este mediata de AP-1 si Ets-1 fiind predominanta în monocite, dar detectata si în unele neoplasme ale celulelor T si B, ca si în unele limfoame de origine incerta, cu celule mari. În promotorul sau, aceasta gena are 5 situri ce pot interactiona cu proteinele nucleare, prezentând secvente pentru AP-1, AP-2 si pentru proteina Jun. Prezinta, de asemenea, secvente pentru factorii Ets-C si Ets-A. Deletia lui Ets are drept consecinta, reducerea marcata a expresiei genei CD11c indusa de ester forboli, în timp ce deletia lui Ets-A conduce la o modesta scadere a expresiei acestei gene. S-a demonstrat ca Ets coopereaza cu siturile AP-1 în procesul reglarii expresiei lui CD11c (81).

Ets în cancer

Proteina c-Ets-1 este asociata cu invazivitatea unor linii celulare de carcinom, unele proteinaze stromale (MMP-2, MT-1, MMP) fiind activate în aceste linii celulare.
S-a comparat contributia potentialului c-Ets-1 cu fenotipul EMT, derivat dintr-un carcinom mamar, în scopul stabilirii expresiei vimentinei, constatându-se ca în doua linii neinvazive vimentina este absenta, iar în alte 4, proteina c-Ets-1 s-a exprimat din abundenta. Nu s-a stabilit cert o relatie cantitativa sau calitativa între expresia c-Ets-1 si cele 3 proteaze care sunt reglate de aceasta. În schimb, proteina se exprima în liniile invazive c-Ets-1 pozitive. De aici sugestia ca, c-Ets-1 poate contribui la formarea fenotipului invaziv EMT al carcinomului mamar (82).
În evolutia leziunilor precanceroase bronsice se constata schimbari ale proteazelor matricei, corelat cu factorul de transcriere c-Ets-1. S-a analizat imunohistochimic, colagenaza-1, stromelisin 1 si 3, matrilisin, uPA-1 si expresia genei c-ets-1. Proteazele matricei si c-Ets-1 care le regleaza sunt frecvent exprimate în carcinoamele invazive. Colagenaza-1 si matrilisinul se exprima în leziunile bronhiolare intraepiteliale si frecvent în carcinoamele bronsice. Stromelisin-1 se exprima inconsistent în 31% din aceste leziuni si în 50% din carcinoame. Stromelisin-3 si uPA-1 sunt, de asemenea, slab exprimate, dar mai mult în leziunile preinvazive si în carcinoame. (83).
Expresia c-Ets-1 în astrocitele umane se asociaza cu sinteza fms-like tirosin-kinaza-1 (FLI-1)/vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-1 si, implicit cu neoangiogeneza. Glioamele maligne se caracterizeaza prin neovascularizare marcata si prin proliferarea endoteliului vascular. Factorul de crestere a endoteliului vascular (VEGF) este o proteina angiogenica secretata de celulele gliale, având un rol crucial în inductia neoangiogenezei. Protooncogena c-ets-1 codifica un factor de transcriere care, in vivo se asociaza cu formarea vaselor de sânge atât în conditii fiziologice cât si patologice, inclusiv în neovascularizarea tumorilor. Ets-1 este un activator transcriptional al FLT-1, ceea ce a incitat investigarea expresiei Ets-1 în 32 tumori astrogliale umane apartinând grupului WHO I-IV în scopul corelarii cu expresia modelului VEGF-FLT-1. Prin hibridare in situ, în microvasele gliomului s-au detectat nivele înalte de mRNA Ets-1, cu semnale particulare marcate pentru proliferarea endoteliului vascular glomeruloid al glioblastomului ( WHO I-IV).
S-au identificat transcripte Ets-1 de lungimi depline, dar nu s-a identificat nici una din cele 3 variante splice cunoscute, care codifica izoforeme cu domenii functionale diferite. Proteina Ets-1 este preferential prezenta în nucleul celulelor endoteliale cu morfologie de stare activa, în timp ce în celulele inactive, proteina este citosolica, ceea ce presupune translocatia ei în timpul neoangiogenezei. Sinteza VEGF din celulele gliomului este însotita de expresia Ets-1 în celulele endoteliale adiacente microvaselor. De asemenea, în celulele endoteliale ale microvasculaturii gliomului, se observa o semnificativa corelatie între expresia Ets-1 si Flt-1. Se sugereaza ca, VEGF secretat de celulele gliomului induce Ets-1 în aceste celule, care ulterior transactiveaza VEGF receptor Flt-1. Aceasta cascada poate promota crucial neoangiogeneza în glioamele umane (84).
Proliferarea si diferentierea epiteliului normal al prostatei, ca si cresterea initiala a celulelor canceroase, sunt dependente de androgeni, în ultima instanta, cancerul de prostata devenind independent de acesti hormoni si refractar la terapia cu ei. Gena antigen-specific prostatei (PSA) este un indice de antigenicitate atât pentru cancerul dependent cât si pentru cel independent de androgeni. PDEF (Prostate-Derived Ets Factor), apartine familiei ETS si actioneaza asupra genei psa, ca activator transcriptional independent de androgeni via promotorului sau. PDEF se cupleaza preferential la GGAT mai curând decât la GGAA si interactioneaza direct cu un domeniu de cuplare a receptorului androgenilor, amplificând activarea promotorului PSA mediata de acestia. Se sugereaza ca, asemenea functiilor critice ale altor factori ETS în diferentierea celulara si în tumorogeneza, si PDEF este un important reglator al dezvoltarii prostatei si/sau cancerului acesteia (85).

MYB-ETS

Virusul leucemiei aviene acute- E26- codifica o oncoproteina de fuziune constituita din versiunile trunchiate ale factorilor de transcriere cMyb si c-Ets-1. Proteina Myb-Ets codificata de acest virus este o paradigma pentru functia oncoproteinelor fuzionate care sunt activatori transcriptionali. Aceasta proteina de fuziune MEP (Myb-Ets-Protein) transforma progenitorii hematopoietici. Secvena Ets a MEP se dovedeste necesara pentru mentinerea multipotentei MEP. Transformata cu o mutanta E26 sensibila la temperatura, MEP (cu o leziune Ets-ts1.1) modifica forma celulelor eritroide, eozinofile si mieloide la temperatura nepermisiva. MEP transformat-ts1.1 difera de MEP transformat de E26 tip-salbatic (86,87).
Retrovirusul E26ABC care detine v-myb si v-ets induce proliferarea celulelor neuroretinei de pui (CNR) în mediu minim, puternic stimulate de factorul de crestere fibroblastic bazal (bFGF) care confera abilitatea de a forma colonii în agar moale. v-ets difera de partenerul sau celular -c-ets-1- prin doua mutatii punct si prin replasarea ultimilor 13 aminoacizi C-terminal. Aceasta diferita secventa C-terminal influenteaza activitatea de legare la DNA. Replasarea în virusul E26ABC a secventei care codifica ultimii 16 aminoacizi C-terminal a v-ets via secventei care codifica 13 c-ets-1 derivat din C-terminal (virus E26ABC) induce productia proteinei p135gag-myb-ets ce modifica proprietatile biologice ale celulelor CNR. Celulele CNR infectate cu E26ABC prolifereaza în mediul minim mai eficient decât E26ABC si raspund la bFGF putând creste în mediul moale (88).
Reglarea expresiei c-myb în celulele leucemice mieloblastice umane ML-1 de catre proteina c-Ets-1 conduce la proliferarea sustinuta caracteristica celulelor transformate. În absenta serului, celulelor ML-1 li s-a administrat IGF-1 si transferina (TF) în scopul stimularii cresteri, iar În scopul stimularii diferentierii lor li s-a administart TGF-beta sau TNF-alpha+ TF. Dupa administarea factorilor de crestere, expresia c-Myb creste timp de o ora, în timp ce ulterior adausului factorilor de diferentiere expresia acesteia înceteaza complet în 3 ore. S-a stabilit o corelatie între nivelul acestei proteine din celulele în care ea s-a legat la intronul 1 al genei c-myb si expresia mRNA c-Myb. S-a observat o crestere intracelulara, îndeosebi intranucleara, a nivelului proteinei c-Ets, în timp ce dupa expunerea la factori de diferentiere se constata o scadere pronuntata a nivelului ei. De aici concluzia ca, nivelul la care se exprima factorul de transcriere, poate afecta expresia altor oncogene, tinte implicate în reglarea proliferarii celulare. Expresia stimulata a unui factor de transcriere poate conduce ulterior la proliferarea ciclica caracteristica celulei canceroase (89).

Gena myb (myeloblastom).

Familia genei myb are 3 membri: c-myb, A-myb si B-myb, care codifica proteine nucleare ce se cupleaza la DNA, în maniera secventa-specifica si functioneaza ca reglatori ai transcrierii. Protooncogena c-myb codifica un factor de transcriere care joaca un rol important în seria celulara hematopoietica, dar si într-o serie de alte tipuri celulare. Astfel, proteina Myb este reclamata în hematopoieza fetala murina, dar si în reglarea cresterii si diferentierii celulelor hematopoietice de la mai multe specii de animale. c-myb este critica pentru organogeneza colonului murin. Colonul mamalian însa, se dezvolta dintr-un tub de celule nediferentiate, care ulterior se constituie într-un organ complex înalt organizat, cu o continua reînoire a epiteliului sau. Este cunoscuta expresia c-myb în epiteliul colonului murin si în criptele colonului uman, dar si expresia crescuta în celulele adenocarcinomului colorectal.
Gene c-myb fragmentate s-au utilizat în timpul dezvoltarii epiteliului colonic la embrionii de soareci, constatându-se ca animalele mor intrauterin. Probe de colon prelevate de la acesti embrioni înainte de a muri, aflati în stadiul E15, s-au transplantat sub capsulele renale la soareci recipienti, în ideia observarii citodiferentierii. Comparativ cu colonul parental de la mame heterozigote, colonul de la femelele homozigote cu c-myb are epiteliul discontinuu si cripte anormale. În plus, expresia Bcl-2 care este o tinta a proteinei c-Myb este redusa si astfel apoptoza este crescuta indicând reclamarea critica a c-myb în dezvoltarea normala a colonului (90).
O forma a c-myb procesata alternativ codifica la pui o secventa aditionala de 120 resturi de aminoacizi, iar la soareci, de 121, aminoacizi codificati de exonul aditional 9A absent din oncogena v-myb, proteinele ce contin acesti aminoacizi nefiind oncogenice.
Cu constructe myb cu sau fara exonul 9A,s-a apreciat importanta aminoacizilor constatându-se ca aminoacizii codificati de acest exon induc proteina c-Myb la o puternica transactivare, desi nu s-a stabilit o corelatie directa ntre nivelele activarii transcriptionale si capacitatea leucemogenica (91).
Majoritatea promotorilor care contin elementul E2F sunt activati tranzitoriu în timpul trecerii din faza G1 în faza S a ciclului celular. În promotorul sau, protooncogena c-myb detine elementul E2F care este indus în faza G1 dupa intrarea în ciclul celular si care ramâne activ si în urmatoarele secvente ale ciclului. Elementul E2F din c-myb poate fi identificat prin cuplarea Sp1. E2F myb si/sau Sp1 sunt reclamate pentru activarea deplina a promotorului c-myb în diferite tipuri celulare, dar si pentru mentinerea crescuta a expresiei în celulele NIH 3T3 a promotorului c-myb în faza G1. Deci, elementul E2F poate fi identific diferit prin cuplarea unor seturi mici de proteine (92).

A-myb

Factorul de transcriere A-myb este un marker in vivo, al centroblastelor. Structural este înrudit cu c-myb si-i implicat în controlul proliferarii si/sau diferentierii limfocitelor B mature, exprimâmdu-se preferential în cele CD38+, CD39- sIgM.
Expresia A-myb este reglata în celulele B normale si în cele din limfomul Burkitt fiind detectabila numai în fazele S si G2/M ale ciclului celular si nu în fazele G0, G1. Proliferarea sustinuta a limfocitelor B umane este indusa de o serie de liganzi cum sunt: CD40, IL-2, IL-4, IL-6, IL-13, IFN-gamma, TNF-gamma. Diferentierea celulelor B din centrii germinali evolueaza fie catre celule cu memorie, fie catre plasmocite, fiind însotita de reglarea redusa a expresiei A-myb;de aici consideratia ca A-myb este un marker al centroblastelor generate in vivo (93).

B-myb

Factorul de transcriere B-myb este o fosfoproteina care regleaza ciclul celular fiind un potent reglator al progresiei acestuia. Se apreciaza ca B-myb murin are potential de transactivator al c-myb. Astfel, mutante prin deletii ale B-myb si c-myb arata ca domeniul C-terminal al c-myb actioneaza ca reglator negativ al transactivarii transcriptionale, iar acelasi domeniu al B-myb, actioneaza ca un amplificator pozitiv al transactivarii. Hiperexpresia celor doua gene în celulele 32Dc13, în prezenta G-CSF, induce diferentierea terminala în granulocite, ceea ce demonstreaza ca c-myb blocheaza constant acest proces ducând la o continua proliferare a celulelor Hiperepresia ectopica a B-myb blocheaza însa abilitatea proliferativa a celulelor 32Dc13, în prezenta G-CSF si accelereaza diferentierea lor în granulocite indusa de acesta. Concluzia este ca, c-myb si B-myb nu au activitate biologica identica, iar domeniul reglator terminal al c-myb joaca un rol critic în functia sa biologica (94).
S-a sugerat ca fosforilarea B-myb în faza S a ciclului celular, s-ar datora kinazei dependente de ciclina; astfel, s-au identificat 10 locuri de fosforilare a peptidului B-myb, fiecare din acestea continând o fosfoserina sau fosfotreonina urmata de prolina, de unde concluzia ca fosforilarea se datoreaza unei kinaze directionata de prolina.
Abilitatea lui B-myb de a activa o plasmida reporter, a fost amplificata prin cotransfectia ciclinei A, în timp ce mutageneza celor 10 locuri de fosforilare, blocheaza efectul coexpresiei ciclinei A. Efectul fosforilarii exprimat prin potentialul de transactivator al B-myb este amplificat de locurile de fosforilare în jumatatea terminala a capatului COOH. Locul de fosforilare (ser-581) apare ca reglator negativ pentru cuplarea la DNA, iar mutatia lui amplifica abilitatea B-myb de a cupla la DNA. Se sugereaza ca B-myb este o tinta pentru fosforilarea prin ciclin-cdk-2, proces care regleaza activitatea sa transcriptionala (95).
Embrionii soarecilor deficienti în B-myb, aflatii în stadiile E4 si E5 mor de timpuriu. Blastocistul în cultura arata ca B-myb este reclamat pentru formarea masei celulare interne. B-myb este singurul membru al familiei myb, care se exprima în celulele stem embrionare (96).

Genele tinta pentru myb

Genele tinta asupra carora actioneaza myb nu s-au cunoscut multa vreme dupa descoperirea proteinelor Myb, dar în ultimii ani s-au identificat câteva. Astfel, recent s-a identificat la pui gena tom-1 ca tinta directa pentru v-myb.Aceasta gena are 2 promotori din care numai tom-1A este activat de v-myb în cooperare însa cu ets-2, unul din membrii familiei factorilor de transcriere ETS. Abilitatea lui v-myb de a coopera cu proteina Ets difera de cea a partenerului sau celular neoncogen c-myb, care însa coopereaza cu ets-1 si cu ets-2, în timp ce v-myb coopereaza, asa cum s-a mentionat, numai cu ets-2. Trunchierea N-terminal a c-myb prin care se activeaza potentialul sau oncogenic abroga specific abilitatea proteinei de a coopera cu ets-1. Aceasta releva faptul ca N-terminus c-myb este oncogenic si nu mai coopereaza cu ets-1. Deci, myb este factor transcriptional cu capacitatea de a induce promotorul genei tom-1 (97).
Proteinele Myb si Ets sunt candidate ca reglatori ai expresiei genei c-kit în celulele hematopoietice umane. Kit este o TK receptor cu rol important în cresterea celulelor hematopoietice. Analiza unui fragment de 1kb care flancheaza 5’uman din promotorul genei,c-kit releva ca o regiune de 139 nucleotide amonte de locul de initiere a transcrierii este critica pentru activarea promotorului. Exista câteva potentiale locuri de cuplare pentru myb si ets de tip-salbatic, dar nu exista proteine mutante myb-deficiente. Cuplarea la acest fragment se face cu myb combinat cu ets-2. Regiunea care flancheaza 5’a c-kit are activitate promotorialâla în celulele nehematopoietice numai în conditiile în care acestea sunt transfectate cu vectori ce exprima c-myb si ets-2. Coexpresia acestora în asemenea celule amplifica transactivarea promotorului c-kit, în comparatie cu ceea ce se observa în celulele transfectate cu fiecare proteina în parte. Se admite ca proteinele Myb si Ets joaca un rol important în functionalitatea promotorului c-kit gena ce codifica un receptor care intervine critic în celulele hematopoietice (98).
Clonarea genei C/EBP de la pui arata ca promotorul acesteia contine un numar de situri de cuplare C/EBP fiind activata de C/EBP beta, de unde sugestia ca aceasta gena se autoregleaza prin însasi produsul ei proteinic. Promotorul C/EBP nu este activat de C/EBP alpha, un alt membru al familiei C/EBP, înalt exprimat în celulele mielomonocitice; de aici concluzia ca autoreglarea este specifica exclusiv pentru C/EBP beta. Promotorul C/EBP beta contine, de asemenea, câteva motifs de cuplare a proteinei Myb sugerând ca gena c/ebp beta este si myb inductibila. S-a demonstrat ca promotorul C/EBP beta este activat sinergic de v-myb si c/ebp beta si, de asemenea, ca transcrierea acestei gene endogene este amplificata de v-myb.; aceasta este deci o noua gena tinta v-myb. Reglarea expresiei ei de catre v-myb stimuleaza sinteza C/EBP beta prin activarea promotorului (99).
CD34 este o glicoproteina de suprafata exprimata specific în stadiile de stem si progenitori ale celulelor maduvei osoase. Se exploreaza un posibil rol al c-myb în reglarea expresiei CD34 în procesul hematopoiezei, ca si ideia ca aceasta protooncogena poate induce expresia CD34 prin activarea promotorului murin al acestuia. Experimentele au demonstrat însa, ca c-myb nu este reclamata pentru expresia CD34 în celulele endoteliale sau hematopoietice primitive din sacul vitelin, dar, în schimb, este necesar pentru hematopoieza definitiva (100).
Ciclina A1 difera de celelalte cicline prin faptul ca se exprima în progenitorii hematopoietici si în leucemia mieloida acuta. Compararea ciclinei A1 cu ciclina A privind activitatea promotorilor în liniile celulelor aderente si din leucemia mieloida, releva ca promotorul ciclinei A1 este preferential activat în liniile mieloide, într-un mic fragment (de 335 p.b) care contine locuri potentiale de cuplare a proteinei c-Myb.
Coexpresia unui vector care exprima c-myb cu un promotor ciclina A1 creste semnificativ activitatea reporter în CV-1 aderent, ca si în celulelee mieloide U937. C-myb s-ar putea cupla la promotorul ciclinei A1, la locul de lânga cel al startului transcrierii. Mutageneza directionata pe acest loc scade cu 50% transactivarea promotorului în celulele KCL22 care exprima nivele înalte de c-myb si în celulele CV-1 transfectate cu c-myb. De asemenea, fibroblastele primare embronare umane transfectate cu un vector care exprima c-myb inducc gena endogena a ciclinei A1. În concluzie, c-myb indue mecanisme specifice hematopoiezei în reglarea ciclului celular (101).
Factorul de transcriere nuclear c-myb desi înalt exprimat în celulele hematopoietice este functional si în celulele NIH3T3 în ciuda faptului ca nivelele sale nu sunt detectabile. Transfectarea în fibroblaste a unor constructe c-myb sau dominant negative (GRE myb si respectiv GRE MEn) de lungimi depline, a condus la identificarea trombospondinei-2 (TSP-2) ca produs genic represat în celulele GRE Myb si indus în celulele GRE MEn. Acest studiu stabileste ca mRNA are un half-life (timp de înjumatatire) TSP-2 mult mai scurt în celulele GRE myb comparativ cu celulele NIH3T de tip-salbatic, sugerându-se faptul ca c-myb afecteaza expresia TSP-2 via unui mecanism post-transcriptional (102).

v-myb

Factorii de transcriere sunt oncogenici, fie în conditiile în care sunt alterati functional prin fuziunea cu alte proteine fie prin expresia lor dereglata.
Factorul de transcriere myb este emblematic sub aspectul faptului ca poate transforma celulele de origini diferite. Astfel, câteva forme de Myb pot transforma diferite linii hematopoietice de pui. De asemenea, este reclamata pentru hematopoieza fetala murina si pentru reglarea cresterii si diferentierii liniilor hematopoietice la diferite alte specii animale (103, 104).
Efectele biologice ale proteinei c-myb si ale corespondentului sau viral-v-Myb sunt strict diferite, deoarece c-myb este indispensabil hematopoiezei normale în timp ce v-myb induce leucemia acuta. Domeniul v-myb DNA-binding (DBD) difera de cel al proteinei c-myb prin deletia primelor 3 “repeats” (secvente de DNA repetitive) ceea ce se coreleaza cu transformarea oncogenica eficienta. V-myb DBD (R2R3) arata o specificitate DNA-binding intrinseca pentru o secventa bogata în AT (105).
Expresia aberanta a protooncogenei c-myb reprezinta un factor cheie în dezvoltarea fenotipului neoplazic într-o varietate de contexte. Pe baza aceasta se admite ca ablatia functiei sale ar putea fi eficienta terapeutic folosind anticorpi anti-c-myb. Deci, protooncogena c-myb codifica un factor de transcriere care joaca un rol important în hematopoieza; modificarea activitatii ei conduce însa, la transformare. În linia celulara TK-6 obtinuta dela un pacient cu leucemie mieloida cronica mieloida în criza blastica, s-a detectat mRNA c-myb trunchiat de 2kb, ca si proteina sa c-Myb de 55kD. Clona c-DNA c-myb mutanta (WTK-1) din c-DNA TK-6 comparata cu tipul salbatic uman, releva ca secventele WTK-1 diverg la capetele 3’ale exonului 9. Proteina codificata de WTK-1 (myb-TK-6) are 402 aminoacizi si este lisita de down-reglatorul negativ al proteinei c-myb normala.
În celulele NIH3T3, metoda cu luciferaza releva ca expresia vectorului care codifica myb (TK-6) stimuleaza promotorul mim-1 reglat de myb mai eficient decât o face proteina c-Myb umana tip-salbatic, sugerând ca myb (TK-6) este un factor de transcriere functional, proteina având astfel potential transformant. Acelasi aranjament al genei c-myb în TK-6 se constata si tarziu în probele pacientului sugerând faptul ca aceasta mutatie este obtinuta în timpul evolutiei bolii (106).
Tax, proteina transformanta HTLV-I este reclamata pentru puternica activare a transcrierii virusului, activare mediata prin interactiunea cu domeniul Kix al proteinei de cuplare CREB care este un coactivator celular (CBP). S-a testat abilitatea lui Tax de a deregla activitatea factorului de transcriere celulara c-myb, deoarece ambele elemente interactioneaza in vitro cu domeniul Kix al CBP si deci cupleaza la acesta. Mecanismul interferentei lor transcriptionale poate promota în celulele infectate cu HTLV-I, expresia genei celulare dereglate, ceea ce duce la aparitia leucemiei (107).
Ciclinele de tip D, D1 si D2 inhiba specific transcrierea când sunt activate prin domeniul v-myb DNA-binding, dar nu prin domeniul c-myb DNA-binding. Nivelele crescute ale acestor doua cicline duc la stabilizarea proteinei Myb, dar nu la alterarea cuplarii lor la DNA. Efectul diferit al ciclinelor D asupra v-myb si c-myb ar explica mecanismul activarii oncogenice a proteinei v-Myb, care apare ca un activator transcriptional mai puternic, urmând diferentierea monoblastelor transformate indusa de TPA când cele doua cicline sunt down-reglate (108).
Proteina c-Myb este controlata de interactiuni moleculare si de mutatii punct, care îi amplifica activitatea oncogenica, astfel ca, schimbarile ei conformationale îi regleaza activitatea.
Ciclofilina cyp-40 si peptidilprolil izomeraza ar putea inhiba activitatea de cuplare c-Myb DNA, ceea ce reclama domeniul C-terminal al proteinei, în timp ce domeniul sau N-terminal catalitic este blocat de ciclosporina A, inhibitorul sau competitiv. Cyp-40 nu cupleaza si deci nu inhiba derivatul oncogenic v-myb care are domeniul de cuplare mutat. Se sugereaza ca mutatiile în proteina v-Myb îi permit evitarea mecanismului reglator negativ mediat de enzime precum Cyp-40 si izoenzimele peptidilprolil, implicate în reglarea transcrierii, transformarii si diferentierii celulare (109).
Anii ’80 au adus primele informatii privind oncogena v-myb, numai ulterior fiind descoperita protooncogena c-myb. Mieloblastomul la pui este declansata de oncogena v-myb din virusul AMV al leucemiei aviene E26. Pe lânga oncogena v-myb acesta detine si oncogena v-ets ce induce eritroblastoza. Oncogena v-myb din virusul AMV codifica o proteina de 45kD, iar virusul E26 codifica proteina p135gag-myb-ets. Protooncogena c-myb codifica o proteina de 75kD –p75-. Toate aceste proteine sunt proteine nucleare; astfel, p45 s-a detectat în nucleii celulelor infectate, dar nu este obligattoriu legata de procesul transformarii.Ea este totusi prezenta si în citoplasma, conditie în care se poate corela cu reversia fenotipului transformat (110).
Produsul oncogenei v-myb din AMV codifica proteina p48v-myb care este, de fapt, forma redusa a p75c-myb din celulele normale. Deci, aceste doua proteine pot functiona ca transactivatori ai expresiei genelor (111, 112).

Ets gene

Ets genes are transcription factors that binds GGAA sequences in the promotor/enhancer regions of the target genes. They are expressed preferentially in the hematopoietic tissue and involved in normal development of these cells. Human ets-1 gene is localized on 11q23 chromosom and it has been demonstrated that regulates erythroid differentiation in vitro after hemin and AraC stimulation of HEL and K562 erythroleukemic cells lines. Human ets-2 gene is a homologue of the viral gene v-ets. The chicken ets-1 gene encodes two proteins, p54 and p68 that differ at their N-terminal end because of the alternative splicing of ets mRNA.
Other members of ets family of genes, related to ets-1 and ets-2, are erg, elk-1, fli-1, etv, pu.1 and spi-B. Ets genes have been implicated in some human chromosomal translocations as well as other retrovirus-induced tumors. Ets genes expression is induced by various citokines and growth factors, among these, TNF-alpha, IL-1-alpha,EGF, TGF-beta, PDGF. Genes that encode citokines and growth factors such as TNF and IL-5, are also targets for the translational transactivating activity of ets.
Several studies shown that ets gene expression, especially ets-1, is associated with the invasion of numerous tumoral cell lines of epithelial and glandular origins and corellates with neoangiogenesis and with expression, regulation and synthesis of VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Ets factors functions, namely PDEF (Prostate-Derived Ets Factor) in cell differentiation and tumorogenesis is also sustained by its implication in normal prostate development and in prostate adenocarcinoma.

Myb gene

C-myb is a member of a multigene family encoding nuclear phosphoproteins with sequence-specific DNA-binding activity. There are described three members of this gene family: c-myb, A-myb and B-myb.
The expression of c-myb appears to be restricted to hematopoietic cells, especially cells of myeloid-macrophage lineage, and to brain. C-myb expression has been shown to be involved in myeloid leukemogenesis, in the murine colon organogenesis, c-myb expression being highly elevated in colorectal adenocarcinoma. A-myb is an in vivo marker for the centroblasts, with possible implication in proliferation and/or differentiation of B lymphocytes. B-myb has been demonstrated to be a potent regulator of the cell cycle progression. The members of myb genes,
c-myb, A-myb and B-myb, are differently expressed in various cell types and they do not have the same biological activity. Cellular myb is essential for myeloid development and, when transduced into certain retroviral forms, can be a potent leukemogenic agent by itself.
The c-myb encoded a protein of 636 aminoacids in length, is highly conserved, with a structural homologue being present in yeast. The N-terminal region of the c-myb product contains a site that is phosphorylated by casein kinase II (CK II), followed the DNA-binding domain. The CK II site is deleted in v-myb protein and it becomes activated in the c-myb products following insertional mutagenesis, suggesting that phosphorylation of this site may regulate the DNA-binding activity of the normal protein. The C-terminal end contains two transactivation domains, a transactivation domain and a negative regulatory region. These regions are possible responsable for the c-myb involvement in both cell proliferation and preventing differentiation of hematopoietic cells.
The myb gene was first characterized as the transforming gene of avian myeloblastosis virus (AVL) and encodes a v-myb p48 kDa protein. The c-myb gene has also been activated by ALV and MLV proviral-mediated intertional mutagenesis.In contrast to many oncogenes, v-myb is not transforming for fibroblasts but is a potent inducer of myeloid transformation.

MYB-ETS

The AVL virus E26 contains an oncogene that resulted from the fusion of truncated viral genes v-myb and v-ets joined the the viral gag sequence. The viral oncoprotein, a transcription factor-type oncogene of E26 avian leukemia virus, is a chimeric product of 135 kDa that contains a portion of the viral gag gene, a myb DNA-binding domain, a myb transactivation domain and an ets DNA-binding domain. The oncogenic function of such chimeras might result either from the additive function of two components or from a unique codependency on the molecular structure of the two joined domains.
Mutants of the Myb-Ets- protein (MEP=Myb-Ets-Protein) have different transformant activity on erythrocyytes and myeloid cells from the wild-type E26 MEP and it has been shown that ets sequence is required for the potenty of MEP. An E26ABC strain of the ALV virus induces cell proliferation of the chicken neuroretina in a minimal medium.
It has been demonstrated that in human myeloblatic cell lines there is a relationship between c-myb and c-ets-1 regulation of expression that leads to sustained cell proliferation during malignant transformation.
Gena jun