ANTIGENELE COMPLEXULUI MAJOR
DE HISTOCOMPATIBILITATE (C M H)

 

Existenţa antigenelor de histocompatibilitate a fost dedusã din faptul cã alogrefele tegumentare sau de organe, nu sunt viabile în organismul receptor. Dupã 7-10 zile, ţesutul transplantat se inflameazã şi curând dupã aceea, grefa este respinsã.

Respingerea grefei este de naturã imunitarã: sistemul imunitar al receptorului de grefã recunoaşte ca nonself, anumite molecule ale celulelor grefei şi se activeazã. Moleculele de suprafaţã ale celulelor grefate, recunoscute ca nonself, sunt denumite antigene de histocompatibilitate. Ele conferã individualitate biochimicã fiecãrui individ.

Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca molecule ale suprafeţei celulare şi care, datoritã diferenţelor biochimice individuale sunt recunoscute de sistemul imunitar al unui organism cu un alotip diferit (cu o altã combinaţie de gene alele la situsul codificator).

Diversitatea biochimicã la nivel individual a acestor molecule, stã la baza unicitãţii biochimice a fiecãrui individ uman şi este determinatã de o diversitate geneticã corespunzãtoare.

Deoarece se comportã ca antigene majore în organismul receptor de grefã, antigenele CMH se numesc şi antigene de transplantare.

În funcţie de capacitatea lor de a stimula rãspunsul imun de respingere a grefei, antigenele CMH sunt tari şi slabe.

Antigenele CMH tari reprezintã principala barierã în calea transplantului de ţesuturi şi organe. La şoarece, moleculele CMH tari aparţin sistemului H-2. Grefele de ţesuturi şi organe între organisme care diferã prin antigenele complexului H-2 ale suprafeţei celulare sunt invariabil respinse în 10-14 zile. Antigenele tari aparţin claselor I şi II.

Antigenele slabe (uşoare) sunt codificate de sistemul minor de histo-compatibilitate şi determinã respingerea lentã a grefei de piele, în circa 200 de zile.

La om, corespondentul sistemului molecular antigenic H-2 de la şoarece este complexul antigenic al sistemului HLA (Human Leucocyte Antigen). Denumirea semnificã faptul cã moleculele sistemului au fost detectate iniţial
(J. Dausset, 1958), pe suprafaţa leucocitelor.

Antigenele complexelor H-2 şi HLA au o varietate antigenicã individualã şi de aceea natura lor chimicã se poate studia numai în populaţii genetic pure (inbred) de şoarece, obţinute prin împerecheri multiple între indivizii aceleiaşi descendenţe.

Structura molecularã a antigenelor CMH clasa I  

Antigenele codificate de genele CMH clasa I sunt glicoproteine de membranã, a cãror regiune C-terminalã se gãseşte în citoplasmã, iar cea N-terminalã este expusã extracelular.

O moleculã CMH clasa I este alcãtuitã dintr-un lanţ H (Heavy) polipeptidic glicozilat (45 kD), în asociaţie strânsã, necovalentã, cu β-2 microglobulina (12 kD), un polipeptid care se gãseşte şi în ser.

Catena H este alcãtuitã din 339 aminoacizi, distribuiţi în urmãtoarele 5 domenii:

- trei domenii extracelulare, în regiunea N-terminalã, notate cu α-l, α-2, α-3, fiecare cu câte 90 de aminoacizi. Sub acţiunea papainei, pot fi clivate de restul moleculei. Domeniile α-2 şi α-3 prezintã legãturi S-S intracatenare şi formeazã bucle de 63 şi respectiv 86 aminoacizi;

- domeniul transmembranar conţine 25 resturi de aminoacizi hidrofobi, care traverseazã membrana. Imediat deasupra acestui domeniu se gãsesc 5 aminoacizi bazici (Arg, Leu), tipici pentru proteinele legate de membranã, cu rolul de a ancora lanţul polipeptidic în membranã;

- domeniul hidrofil cito-plasmatic (30 de aminoacizi la om, 40 la şoarece), conţine în special serinã, unele resturi
fiind fosforilate, este implicat în transmiterea semnalului de la domeniile extracelulare, la mediatorii citoplasmatici. Acest domeniu conţine resturi de cisteinã cu rol în legarea prin intermediul punţilor S-S, de alte catene H sau de proteine citoplasmatice.

Componenta glucidicã este alcãtuitã din douã grupãri, fiecare fiind formatã din 12-15 resturi de zaharuri, ataşate de domeniile α-1 şi α-2. Sunt oligozaharide care conţin manozã, de care se leagã catene laterale de glucozaminã şi acid sialic.

Catena H are o regiune variabilã în jumãtatea N-terminalã, cu douã subzone hipervariabile, care diferã prin mai mult de 60% din aminoacizi, de la un organism la altul, localizate în domeniile α-1 şi α-2. Studiile prin difracţie cu raze X ale domeniilor extracelulare, cristalizate dupã clivarea cu papainã aratã cã domeniile α-1 şi α-2 sunt foarte asemãnãtoare ca secvenţã de amino-acizi şi prin pliere formeazã împreunã o cavitate molecularã, presupusã a fi situsul de legare stabilã a epitopului antigenic. Cavitatea, susţinutã de secvenţe β-pliate ale aceloraşi domenii α-1 şi α-2, este ocupatã de o moleculã linearã, care este un peptid ce cristalizeazã concomitent cu catena H. Situsul cavitar, dupã ce leagã antigenul, formeazã un complex recunoscut de limfocitele TCD₈. Restul catenei H corespunde regiunii constante.

Fig.53.a. Reprezentarea schematicã în “ochi de pasãre” a suprafeţei superioare a moleculei CMH clasa I umane, bazatã pe structura obţinutã în cristalografie cu raze x. Secvenţele β-pliate care formeazã baza cavitãţii sunt marcate prin sãgeţi groase, orientate în direcţia amino-carboxil. Secvenţele α-helicale sunt reprezentate prin liniile groase spiralate. Suprafeţele interne ale celor douã helice şi faţa superioarã a secvenţelor β-pliate formeazã o cavitate. Cele douã sfere negre reprezintã o legãturã S-S ntracatenarã. b. Vedere lateralã a aceleiaşi molecule, care aratã anatomia cavitãţii şi plierea domeniilor α-3 şi β-2 m (4 catene β-pliate antiparalele pe o faţã şi 3 pe cealaltã) (dupã Roitt, 1997)

β-2 microglobulina (β-2 m) (o globulinã micã, ce migreazã la electroforezã în regiunea β-2) a fost descoperitã în 1968, în urina pacienţilor cu disfuncţie renalã provocatã de intoxicaţia cronicã cu cadmiu. Este sintetizatã de majoritatea celulelor din organism. Conţine circa 100 aminoacizi, cu uşoare variaţii numerice. Nu prezintã variabilitate detectabilã pe cale chimicã sau imunologicã şi nu este glicozilatã.

Ca şi domeniul α-3 al catenei H, β-2 m prezintã omologie a secvenţei de aminoacizi cu domeniile constante ale moleculei de Ig. Secvenţa de aminoacizi a β-2 m formeazã un singur domeniu stabilizat printr-o punte S-S, între douã resturi de cisteinã.

β-2 m se asociazã necovalent cu lanţul H al moleculei CMH clasa I, prin interacţiunea cu domeniul α-3, dar studiile recente de cristalografie cu raze X, sugereazã un contact extins cu toate cele trei domenii. Moleculele de β-2 m legate, se aflã în echilibru cantitativ cu cele din plasmã.

Asocierea celor douã catene se face dupã terminarea sintezei lor şi este o condiţie obligatorie pentru transportul moleculelor CMH I de la reticulul endoplasmic la membrana citoplasmaticã şi pentru ancorarea lor în membranã. Celulele liniei Daudi (derivatã din limfomul Burkitt), deşi sintetizeazã catena H, nu exprimã molecule CMH I, deoarece nu sintetizeazã β-2 m.

Moleculele CMH I au un turnover constant. Cele vechi se elibereazã şi trec în circulaţie sau sunt endocitate şi se sintetizeazã altele noi. Stabilitatea lor este condiţionatã  de rata disocierii peptidului şi β-2 m. Catenele H libere se denatureazã şi sunt degradate.

Moleculele CMH clasa I sunt adevãrate “certificate de identitate” biochimicã şi geneticã, pentru fiecare organism, datoritã polimorfismului lor biochimic foarte accentuat. Ele vegheazã la pãstrarea homeostaziei biochimice a organismului şi devin ţinta sistemului imunitar în urmãtoarele situaţii:

dupã grefarea ţesuturilor şi organelor care poartã molecule incompatibile;

dupã ce se asociazã cu antigenele virale, tumorale sau cu cele induse de agenţii chimici;

dupã modificarea biochimicã printr-un proces mutaţional.
 

Structura molecularã a antigenelor CMH clasa II  

Antigenele CMH clasa II-a sunt glicoproteine heterodimere de membranã, formate din douã catene diferite, notate cu α şi β.

Prin solubilizare cu detergent, aceste molecule se elibereazã întregi. Lanţul α are 30-34 kD, iar lanţul β are 26-29 kD.

Fiecare catenã este formatã din 4 domenii:

- douã extracelulare, alcãtuite din circa 90 de aminoacizi fiecare, notate cu α-1, α-2, respectiv β-1, β-2;

un domeniu transmembranar (circa 30 de aminoacizi);

un domeniu citoplasmatic (10-15 aminoacizi).

Domeniile α-1 şi β-1 au o variabilitate accentuatã a secvenţei de aminoacizi. Ele se asociazã pentru a forma o structurã ce delimiteazã o cavitate în care este legat peptidul antigenic.

Domeniile α-2 şi β-2 pre-zintã omologie a secvenţei de aminoacizi, cu domeniile mole-culei de Ig.

Domeniile α-2, β-1 şi β-2 sunt stabilizate prin legãturi S-S, iar domeniile α-1, α-2 şi β-2 sunt gli-cozilate. Gruparea glucidicã conţine manozã, galactozã, fucozã, glu-cozaminã. Diferenţele greutãţii mo-leculare a celor douã catene se dato-reazã nivelului diferit de glicozilare.  

Determinismul genetic al moleculelor CMH  

Moleculele CMH sunt codificate de genele complexului major de histocompatibilitate. Calificativul “complex” este justificat de numãrul mare de gene componente, iar cel de “major” semnificã importanţa deosebitã a moleculelor codificate de aceste gene, în realizarea unor funcţii imunitare importante:

-elaborarea rãspunsului imun

-respingerea grefelor de ţesuturi şi organe.

În raport cu tipul de proteine pe care le codificã, genele CMH aparţin clasei I şi clasei a II-a.

La şoarece, genele CMH codificatoare ale moleculelor complexului antigenic H-2 sunt localizate pe cromosomul 17, într-un fragment de 2000-4000 kb perechi, suficient de mare pentru a codifica circa 200 de proteine de dimensiuni medii. In acest complex se gãsesc 3 tipuri de gene descoperite independent:

-primul grup de gene (descoperit în anii ’40) codificã antigenele “tari” de transplantare, care induc respingerea rapidã a grefelor de tegument şi de organe, între indivizi neidentici genetic (aparţin unor alotipuri diferite). Acestea sunt genele CMH clasa I, care codificã moleculele CMH clasa I;

-al II-lea grup, denumite genele rãspunsului imun (IR) codificã sinteza unor molecule care condiţioneazã intensitatea rãspunsului imun al organismului, slab sau puternic, faţã de un antigen. Genele IR codificã proteinele clasei a II-a de molecule CMH, denumite şi molecule Ia (I associated);

-al III-lea set de gene ale complexului CMH codificã sinteza unor componente ale complementului. 

La şoarece, moleculele CMH I sunt codificate de gene situate la extremitãţile complexului genic H-2, notate K şi D. Gena K are circa 55 de variante alelice. Fiecare variantã codificã proteine distincte. 

Fig. 55. Reprezentare diagramaticã a localizãrii subregiunilor genice CMH la şoarece şi om şi poziţia genelor majore în aceste subregiuni. La om, locusurile genice clasa II-a sunt localizate între centromer şi locusurile clasei I, ca şi la alte specii de mamifere.

  Complexul H-2 la şoarece (pe cromosomul 17).

Regiunea cromosomalã	K	I	S	D
Clasa	I	II	III	I
Locusuri genice	K	A, E	C4, C2, Bf, TNF	D, L

 La om, moleculele CMH clasa I sunt codificate de genele HLA, iar moleculele CMH II, de regiunea cromosomalã D, localizate pe cromosomul 6.

Moleculele CMH I sunt codificate de trei gene: HLA-A, HLA-B, HLA-C. S-au descris genele HLA-E, -F, -G, -H şi -J, dar acestea sunt considerate gene neclasice pentru cã produsele lor de sintezã se deosebesc structural şi funcţional de ale genelor HLA-A, -B şi –C.

Moleculele CMH II sunt codificate de regiunea cromosomalã HLA-D, ce aparţine genelor clasei a II-a.

Genele clasei a III-a codificã sinteza aceloraşi proteine plasmatice (C4, C2, Bf).

Complexul HLA (pe cromosomul 6).  

Regiunea cromosomalã	D	C4, C2, Bf	B C A	E, F, G, H, J
Clasa	II	III	I	Gene neclasice
Locusuri genice	DP, DQ, DR	C4, C2, Bf	B C A	E, F, G, H, J

Genele HLA clasa I şi II au cel mai înalt grad de polimorfism genetic dintre toţi determinanţii genici cunoscuţi ai organismului uman:

HLA-A are 83 de alele

HLA-B, 185 de alele

HLA-C, 42 de alele.  

Numãrul alelelor este în continuã creştere pe mãsurã ce se identificã noi variante. Polimorfismul genic este consecinţa existenţei a cel puţin douã alele pentru un locus. Pe fiecare din cei doi cromosomi pereche, un individ prezintã 3 gene CMH diferite (HLA-A, HLA-B, HLA-C). Celulele umane prezintã 6 variante diferite de gene clasa I, câte trei de la fiecare pãrinte. Genele CMH I sunt codominante, astfel cã pe suprafaţa fiecãrei celule se exprimã produsele de sintezã ale ambelor alele parentale. Se sintetizeazã astfel 6 variante biochimice de molecule CMH I.

Într-o populaţie umanã, moleculele CMH I şi CMH II sunt foarte diferite din punct de vedere biochimic, ca o expresie a polimorfismului genic al indivizilor umani.

Antigenele HLA-A, B şi C sunt antigenele majore recunoscute de sistemul imunitar al gazdei, în reacţia de respingere a grefei. Cantitativ, moleculele HLA-C sunt inferioare faţã de HLA-A şi HLA-B. Toate sunt capabile sã prezinte antigenul. Moleculele CMH neclasice (E, F, G) nu prezintã antigenul.

Polimorfismul biochimic al moleculelor CMH I este limitat la domeniile α 1 şi α 2, la nivelul secvenţelor ce formeazã cavitatea molecularã. 

Genele CMH II sunt localizate în regiunea HLA-D. Regiunea genicã HLA-D controleazã rãspunsul limfocitelor în amestec. Specificitãţile alelice ale genelor CMH II au fost definite prin tipizare limfocitarã şi aparţin locusurilor Dw şi HLA-DP sau prin tipizare serologicã şi aparţin locusurilor HLA-DP, DQ, DR.

Regiunea D este divizatã în trei subregiuni funcţionale majore, care codificã moleculele DR, DQ şi DP. In subregiunile DQ şi DP se gãseşte o pereche de gene funcţionale DQA₁ şi DQB₁, respectiv DPA₁ şi DPB₁, care codificã cele douã catene (α şi β) ale moleculei CMH II.

Subregiunea DR este mai complexã. Ea conţine o singurã genã pentru sinteza catenei α, DRA₁ şi una sau douã gene pentru sinteza catenei β (DRB₁, DRB₃, DRB₄ sau DRB₅).

Nr. alelelor
DRA1	2
DRB1	184
DRB3	11
DRB4	8
DRB5	12
DQA1	18
DQB1	31
DPA1	10
DPB1	77

   

Ca şi genele codificatoare ale moleculelor CMH I, genele codificatoare ale moleculelor CMH II sunt codominante. Se sintetizeazã astfel 8 variante biochimice de molecule CMH II (deoarece sunt douã gene codificatoare ale genei β pentru mlecula HLA-DR).

Combinarea aleatorie a numãrului mare de alele explicã polimorfismul extensiv al moleculelor CMH într-o populaţie umanã. Numãrul combinaţiilor genice posibile între aceste alele este evaluat la circa 10⁹⁰, un numãr cu mult mai mare decât al indivizilor umani care coexistã la un moment dat. In contextul existenţei unui numãr mare de gene alele codificatoare, posibilitatea ca doi indivizi neînrudiţi sã aibã proteine identice ale moleculelor CMH clasele I şi II este micã. Nu existã doi indivizi identici pentru toate cele 6 variante de molecule CMH I şi pentru cele 8 variante de molecule CMH II.

Moleculele CMH I şi II au rolul de a lega peptidele antigenice. O variantã molecularã poate sã lege un numãr limitat de peptide antigenice(de ordinul milioanelor), dar probabilitatea unei potriviri spaţiale creşte mult prin existenţa a 6 variante de molecule CMH I şi a 8 variante de molecule CMH II.

Peptidul antigenic este legat deosebit de stabil în situsul cavitar al moleculelor CMH I şi II.  

Evaluarea diferenţelor antigenice ale moleculelor CMH  

Fiecare organism are o specificitate antigenicã proprie conferitã de moleculele CMH clasa I. Diferenţele antigenice dintre indivizii alotipici ai unei specii, dependente de moleculele CMH I se evalueazã serologic. Serul imun specific anti-molecule CMH se obţine prin injectarea unei suspensii de leucocite, la un organism al aceleiaşi specii, diferit din punct de vedere genetic, adicã un organism cu o altã combinaţie de gene alele codificatoare ale moleculelor CMH I. Organismul receptor sintetizeazã anticorpi faţã de antigenele HLA ale leucocitelor donorului, care se deosebesc de propriile sale molecule.

Specificitatea antigenicã a unui organism poate sã conste în prezenţa unei molecule antigenice pe sau în celulele sale, care nu existã pe sau în celulele altor organisme sau se datoreazã unor diferenţe structurale fine ale moleculelor de histocompatibilitate, prezente la toate organismele speciei, în variante genetice distincte.

Anticorpii anti-HLA se gãsesc în serul femeilor multipare şi se sintetizeazã ca rezultat al stimulãrilor antigenice HLA de origine paternã, exprimate pe celulele fãtului, dar absente pe suprafaţa celulelor organismului matern. Leucocitele fãtului care strãbat bariera placentarã trec în circulaţia maternã şi induc sinteza IgG, cu persistenţã îndelungatã în circulaţie.

O altã sursã de ser imun anti-HLA o constituie pacienţii politransfuzaţi. Astfel ei se imunizeazã faţã de antigenele HLA alotipice de pe suprafaţa leucocitelor donorilor de sânge.

Antiserurile HLA se pot obţine prin imunizarea voluntarilor.

Diferenţele antigenice dintre doi indivizi, determinate de moleculele CMH clasa II-a se evalueazã prin capacitatea lor de a iniţia reacţia limfocitarã mixtã (RLM). Limfocitele de la doi indivizi ce poartã alele diferite la locusul HLA-D sunt co-cultivate in vitro. Condiţia reactivitãţii limfocitare este diferenţa unei singure alele la locusul ce codificã aceste molecule.

Indivizii care au molecule CMH I identice nu reacţioneazã serologic, dar dacã celulele lor diferã prin moleculele CMH II, codificate de alele diferite ale locusului HLA-D produc un rãspuns intens în RLM.

Într-un amestec de celule limfoide homozigote aa şi bb se activeazã ambele populaţii de limfocite, deoarece limfocitele aa reacţioneazã faţã de antigenul b, iar limfocitele bb se activeazã faţã de antigenul a. Intr-un amestec de limfocite homozigote aa, cu populaţia de limfocite heterozigote ab, rãspund numai limfocitele aa. Rãspunsul bidirecţional apare şi în amestecul limfocitelor ac şi ab.

De obicei se evalueazã capacitatea limfocitelor receptorului de grefã de a se activa faţã de antigenele donorului şi pentru a induce un rãspuns unidirecţional, populaţia de limfocite a donorului este tratatã cu mitomicinã C (un inhibitor al sintezei ADN) sau este iradiatã. Tratamentul nu modificã imunogenitatea celulelor. Funcţia stimulatoare a celulelor limfoide este restrânsã la celulele specializate prezentatoare de antigen, radiorezistente şi care nu se divid in vitro. Rãspunsul celulelor în RLM este orientat exclusiv faţã de moleculele CMH I şi II. Moleculele CMH II constituie un stimul primar esenţial pentru RLM.

Moleculele CMH clasa I şi II au rol esenţial în elaborarea rãspunsului imun, iar din punct de vedere antigenic, determinã respingerea alogrefelor (grefe între indivizi ai aceleiaşi specii, dar aparţinând unor alotipuri diferite).  

Distribuţia tisularã a moleculelor CMH I şi II şi semnificaţia lor evolutivã

 Moleculele CMH I se gãsesc pe suprafaţa majoritãţii ţesuturilor, pe celulele endoteliale ale capilarelor, iar leucocitele exprimã cea mai înaltã densitate a moleculelor CMH I: 1% din moleculele de suprafaţã ale membranei leucocitare sunt molecule HLA.

Moleculele CMH I au o densitate mai micã pe suprafaţa celulelor hepatice, din plãmân, rinichi şi sunt foarte diluate pe suprafaţa celulelor musculare şi a celor mai multe glande endocrine (cu excepţia suprarenalelor).

Moleculele CMH II sunt exprimate predominant, pe suprafaţa limfocitelor B şi pe celulele specializate pentru prelucrarea şi prezentarea antigenelor: celulele seriei monocit-macrofag, celulele endoteliale ale capilarelor sanguine şi limfatice, celulele Kupffer, celulele dendritice, eozinofile, microglia SNC.

Moleculele CMH lipsesc pe eritrocite, pe celulele endoteliului corneean, pe componenta exocrinã a pancreasului, pe celulele acinare ale glandelor parotide, pe neuronii SNC, pe celulele endoteliale ale capilarelor SNC, pe ţesutul placentar.

În condiţii normale, o formã solubilã de molecule HLA se gãseşte în plasmã. Nivelul ei creşte marcat în timpul infecţiei virale, probabil datoritã creşterii ratei sintezei moleculelor HLA, stimulatã de interferon şi de alte citochine.

Intensitatea exprimãrii noleculelor CMH II este variabilã, fiind controlatã de diferiţi factori: interferonul γ şi IL-2, sintetizaţi de limfocitele T, amplificã nivelul de exprimare a moleculelor CMH II, iar PGE₂, glucocorticoizii, α-fetoproteina, LPS din bacteriile Gram negative, diminuã  densitatea acestor molecule, având astfel rol imunosupresor.

Limfocitele B şi celulele tumorale secretã molecule CMH II.

Privitã în perspectiva evoluţiei, existenţa moleculelor CMH nu semnificã respingerea grefelor de ţesuturi şi organe, deoarece acestea nu se realizeazã în mod natural, ci au fost introduse în practica medicalã a ultimelor decenii. In sens evolutiv, existenţa moleculelor CMH ar putea fi atribuitã necesitãţii organismelor de a semnaliza rapid, celulele care prezintã molecule antigenice pe suprafaţa lor: celulele infectate cu virusuri sau cele transformate malign. In acest context, moleculele CMH au o semnificaţie deosebitã: pentru supravieţuirea organismului, liza celulelor purtãtoare de molecule nonself trebuie sã fie rapidã, înainte ca virusul sã se multiplice şi respectiv, înainte ca celula malignã sã se dividã şi sã formeze o microtumorã.

Pentru ca intervenţia limfocitelor Tc sã fie eficientã, este necesar ca moleculele CMH sã fie prezente pe oricare celulã ce poate fi infectatã de un virus sau poate sã fie transformatã malign. Pe de altã parte, moleculele CMH, al cãror rol esenţial este acela de a prezenta epitopii nonself, trebuie sã permitã acţiunea eficientã şi rapidã a limfocitelor Tc.

Moleculele CMH îndeplinesc şi funcţii neimune. Moleculele CMH I sunt componente ale receptorilor de hormoni. De exemplu, linia celularã stabilizatã Daudi nu exprimã moleculele CMH I şi nu are nici receptor pentru insulinã, deoarece nu sintetizeazã β 2-microglobulina.