p 8 p p

VACCINURI

Vaccinurile sunt produse biologice care conţin bacterii vii cu virulenţã atenuatã, bacterii omorâte, toxine modificate (anatoxine), virusuri infecţioase dar cu virulenţã atenuatã, respectiv virusuri inactivate şi care, introduse pe o cale adecvatã în organismul uman sau animal, stimuleazã reactivitatea imunitarã, generând o stare de protecţie temporarã faţã de agentul infecţios din care au fost preparate.

Preparatul vaccinal trebuie sã fie eficient, adicã sã inducã un rãspuns imun protector, a cãrui memorie sã se pãstreze în timp şi, pe de altã parte, sã prezinte un grad înalt de siguranţã, adicã sã nu determine efecte secundare defavorabile.

Administrarea unui vaccin se face pe baza unei strategii bine definitã. Scopul vaccinãrii poate fi eradicarea, eliminarea sau limitarea unui proces infecţios.

Eradicarea semnificã dispariţia agentului patogen, consecutiv acţiunii de vaccinare.

Eliminarea corespunde dispariţiei manifestãrilor patologice, deşi agentul patogen se pãstreazã în populaţia umanã sau animalã.

Limitarea semnificã posibilitatea controlului unei maladii infecţioase pânã la un nivel la care nu mai reprezintã o problemã de sãnãtate publicã.

În general, vaccinurile se administreazã înainte de a se produce infecţia cu tulpina sãlbaticã a agentului patogen. Face excepţie vaccinul rabic, care se administreazã dupã ce s-a produs o presupusã infecţie. Faptul este posibil, deoarece infecţia rabicã are o perioadã lungã de incubaţie şi permite ca preparatul vaccinal sã inducã un rãspuns imun eficient, care modificã evoluţia infecţiei cu o tulpinã de virus "de stradã".

Dupã conţinutul lor, vaccinurile pot fi monovalente, adicã includ antigenele unei singure tulpini bacteriene sau virale (de exemplu, vaccinul stafilococic), bi-, tri- sau polivalente, care conţin antigene provenind de la douã, trei sau mai multe specii de microorganisme sau tulpini virale (de exemplu, vaccinul diftero-tetano-pertusis).

Dupã provenienţa agenţilor patogeni utilizaţi la prepararea unui vaccin, se disting autovaccinuri şi stocvaccinuri. Autovaccinul este vaccinul preparat cu o tulpinã a unui microorganism sau a unui virus, izolatã de la un bolnav şi destinat a fi folosit numai pentru vaccinarea pacientului de la care s-a fãcut izolarea. Stocvaccinurile se obţin din amestecul mai multor tulpini de agenţi infecţioşi şi sunt destinate imunizãrii întregii populaţii susceptibile.

Vaccinuri de origine bacterianã
 

Vaccinurile vii constau din suspensii de bacterii vii, dar cu virulenţã atenuatã, astfel încât sã nu determine o infecţie aparentã, dar sã rãmânã capabile sã iniţieze un proces infecţios inaparent, cu efect imunizant. Vaccinurile vii conţin celule viabile, slab virulente şi care, dupã administrare, induc o imunitate solidã, comparabilã celei consecutive trecerii prin boalã, dar produc  cel mult semne minime de îmbolnãvire. Indiferent de locul inoculãrii, agentul infecţios din vaccinul viu nu rãmâne localizat, ci se rãspândeşte în organism, pãtrunzând şi multiplicându-se în aceleaşi ţesuturi în care se localizeazã şi în cazul infecţiei naturale, dar infectând un numãr mic de celule sensibile şi multiplicându-se lent, agentul infecţios din vaccin nu declanşeazã o boalã clinicã, ci numai o infecţie de formã atenuatã, care este însoţitã de modificãri umorale şi de reactivitate imunitarã.

Pentru prepararea vaccinurilor vii se utilizeazã mutante bacteriene cu virulenţã atenuatã, selecţionate prin cultivarea unor tulpini sãlbatice în condiţii speciale: de exemplu, cultivarea la o temperaturã superioarã celei optime în cazul bacilului cãrbunos – Bacillus anthracis, sau prin acţiunea unor substanţe chimice şi utilizarea unor medii de cultivare care oferã condiţii nefavorabile (vaccinul BCG).

Vaccinurile omorâte constau din suspensii bacteriene omorâte prin încãlzire la temperaturi ridicate (60^o), ori sub acţiunea formolului sau a fenolului şi care conţin una din aceste substanţe ca prezervant. Din aceastã categorie fac parte vaccinul tifo-paratific A şi B (TAB), vaccinul pertusis (din Bordetella pertusis), vaccinul stafilococic. Proprietãţile imunogene ale vaccinurilor bacteriene omorâte se menţin intacte.

Anatoxinele (toxoizii) sunt preparate biologice cu proprietãţi imnogene, derivate din toxine. Uneori, toxinele se transformã spontan în derivaţi lipsiţi de toxicitate, dar pãstreazã proprietãţile de imunogenitate şi specificitate ale toxinei native. Mecanismul molecular al inactivãrii toxinelor nu este cunoscut. Inactivarea este un proces lent şi progresiv, dependent de pH, temperaturã, prezenţa ionilor sau a proteinelor contaminante, de procesul învechirii preparatului. Un factor major al inactivãrii pare a fi proteoliza parţialã a moleculelor de toxinã sub acţiunea proteazelor contaminante, dar şi schimbarea conformaţiei moleculei, polimerizarea sau clivarea unui fragment molecular pot acţiona în acelaşi sens.

Inactivarea toxinelor şi transformarea lor în produse atoxice are loc în condiţii dirijate, sub acţiunea formolului 4%_o, la 37^o şi rezultã anatoxine. Fenomenul a fost descoperit de Ramon (1925). Beta-propiolactona, 2-4-dinitrofluorbenzenul şi glutaraldehida au aceleaşi efecte asupra toxinelor.

Pentru a fi utilizatã ca vaccin, o anatoxinã trebuie sã îndeplineascã urmãtoarele condiţii: a) sã fie imunogenã şi sã inducã sinteza anticorpilor la un titru suficient pentru a neutraliza in vivo, toxina nativã; b) sã fie complet lipsitã de toxicitate; c) sã nu aibã proprietãţi alergizante. Anatoxina idealã ar putea fi produsã de microorganisme manipulate genetic sau prin mutaţii ale genei codificatoare a toxinei. Ea ar fi o proteinã netoxicã, dar cu aceleaşi proprietãţi de imunogenitate cu ale toxinei native, capabilã sã inducã sinteza anticorpilor neutralizanţi.

Condiţiile optime pentru obţinerea anatoxinelor sunt proprii fiecãrei toxine şi au fost optimizate empiric, dar mecanismele moleculare ale inactivãrii nu se cunosc. În general, condiţiile optime pentru obţinerea anatoxinelor sunt urmãtoarele:

- concentraţia proteicã trebuie sã fie de 1 mg/ml, iar cea de formol, de 1,3 mg/ml;

- temperatura de detoxifiere este de 37-40^o;

- pH-ul optim este de 7,8-8,2 pentru toxinele diftericã şi tetanicã şi 5,5 pentru cea botulinicã;

- durata contactului cu formolul este de 3-5 sãptãmâni.

Detoxifierea începe simultan cu adãugarea formolului. Procesul de detoxifiere este evident dupã un minut şi creşte exponenţial timp de 24 de ore, când toxicitatea are valoare foarte scãzutã şi tinde spre 0, la 5 zile. Forma netoxicã poate reveni total sau parţial la forma toxicã. De aceea este necesarã prelungirea contactului cu formolul, o perioadã mai lungã de timp. Molecula de anatoxinã are o structurã stabilizatã, prin formarea legãturilor noi între formol şi resturile de aminoacil, dar în acelaşi timp, prin acţiune prelungitã, formolul are rolul unui agent de reticulare pentru cã favorizeazã formarea legãturilor între moleculele proteice identice, ceea ce explicã polimerizarea unor anatoxine.

Anatoxinele bacteriene, ca şi exotoxinele sunt foarte imunogene pentru om, cal, caprã, iepure, cobai, în special dupã asocierea cu adjuvanţi (fosfat de Ca). Ele se pot administra ca vaccinuri pentru imunizarea activã sau se folosesc pentru imunizarea animalelor în vederea obţinerii serurilor imune utilizabile în seroterapie.

Vaccinuri virale  

Vaccinurile virale sunt de trei categorii:

1) Vaccinuri cu virus activ (infecţios) atenuat;

2) Vaccinuri cu virus inactivat (neinfecţios).

Ambele categorii sunt vaccinuri unitare.

3) Vaccinuri subunitare.

Vaccinuri unitare

Vaccinurile cu virus atenuat se obţin din tulpinile virale atenuate, lipsite complet sau aproape complet de patogenitate, dar îşi pãstreazã capacitatea de a induce un rãspuns imun protector. Fiind infecţioase, ele se multiplicã în organismul vaccinat şi produc o stimulare antigenicã continuã, într-un interval de timp.

Vaccinarea cu virusuri atenuate conferã o imunitate de duratã, dupã administrarea unei singure doze.

Atenuarea virusurilor se obţine pe mai multe cãi.

1) Utilizarea pentru vaccinare, a unui virus înrudit, de la o altã gazdã. Cel mai vechi vaccin viral (Jenner, l798), utilizat în controlul variolei, este virusul vaccinal, recoltat din leziunile pustulare de pe ugerul vacii. Virusul vaccinal imunizeazã încrucişat cu virusul variolei (smallpox) şi este protector faţã de infecţia variolicã.

Virusul rujeolei imunizeazã câinele faţã de virusul bolii Carré. Anticorpii faţã de virusul rujeolei neutralizeazã virusul bolii Carré, dar nu şi invers.

Calea de abordare a lui Jenner pentru obţinerea preparatelor virale utilizabile ca vaccinuri umane este folositã şi astãzi. Ea implicã izolarea unor virusuri de la mamifere sau de la pãsãri, înrudite antigenic cu diferite virusuri umane. Pasajul lor în celulele diploide umane (CDU) in vitro, echivaleazã cu procesul atenuãrii. Celulele diploide umane reprezintã un substrat semipermisiv pentru virusurile umane şi mamaliene şi adeseori, multiplicarea lor este lipsitã de eficienţã.

Genele  virusurilor mamaliene şi aviare, care determinã spectrul de gazdã au o mare diversitate a secvenţelor de nucleotide, faţã de genele corespunzãtoare ale virusurilor umane. Efortul de a realiza noi vaccinuri, pe calea clasicã a lui Jenner, trebuie sã se sprijine pe tehnicile de geneticã viralã, biologie molecularã şi imunologie.

2) Inocularea virusului patogen sau parţial atenuat, pe o cale “nenaturalã”, adicã alta decât cea prin care virusul pãtrunde în mod obişnuit în organism. Metoda este folositã pentru vaccinarea animalelor (de exemplu, virusul laringotraheitei pãsãrilor, se administreazã prin instilare în ochi). Pentru om, metoda nu se foloseşte, deoarece riscul infecţiei este mare.

3) Pasajul virusului de origine umanã într-un substrat “nenatural”, in vivo sau in vitro. Cele mai importante vaccinuri pentru om şi animale s-au obţinut pe aceastã cale. Virusul se cultivã în mod repetat, prin inoculare la organisme sãnãtoase sau în culturi primare de celule: virusul febrei galbene s-a inoculat la şoarece şi apoi în embrionul de gãinã; poliovirusul s-a inoculat în celulele de rinichi de maimuţã; virusul rujeolei – în fibroblaste de embrion de gãinã.  Pasajul într-un substrat celular “nenatural”, selecţioneazã mutante printr-un cumul de evenimente mutaţionale întâmplãtoare. In practica vaccinãrii, se utilizeazã cele cu proprietãţi adecvate de atenuare şi imunogenitate. Mutantele care dupã administrare rãmân localizate la poarta de intrare, sunt cele mai utile. Unul din marile succese ale acestei metode de atenuare este vaccinul polio. Prin pasaje succesive în culturile celulare de rinichi de maimuţã, s-a selectat o linie lipsitã de neurovirulenţã, dupã inocularea intracerebralã sau intraspinalã la maimuţã. Vaccinul rubeolic s-a obţinut prin cultivarea virusului pe acelaşi substrat, iar liniile folosite ca vaccin rujeolic şi al febrei galbene s-au cultivat pe fibroblaste de embrion de gãinã.

Vaccinarea cu un preparat viral atenuat echivaleazã cu o infecţie uşoarã, asimptomaticã.

Vaccinurile virale atenuate au avantajul important al stimulãrii ambelor compartimente ale rãspunsului imun: celular şi humoral, atât sistemic cât şi local. Acest fapt este deosebit de important pentru infecţiile virale în care imunitatea mediatã celular are un rol esenţial în eliminarea virusului, cât şi pentru infecţiile mucoaselor, în care atât imunitatea localã cât şi cea sistemicã, sunt necesare pentru rezistenţa optimã.

Vaccinurile virale atenuate stimuleazã rãspunsul imun faţã de fiecare din antigenele protectoare ale unui virus. Imunitatea indusã de aceste vaccinuri este mai durabilã, mai eficientã şi are un spectru mai larg de reactivitate încrucişatã, decât cea indusã de virusurile inactivate. Reactivitatea încrucişatã este foarte importantã pentru virusurile care suferã variaţie antigenicã progresivã.

Virusurile atenuate din vaccinuri, pãstrându-şi capacitatea de multiplicare în organismul vaccinat, se rãspândesc în populaţie şi imunizeazã chiar indivizi nevaccinaţi.

Vaccinurile atenuate se produc cu un preţ de cost mai scãzut şi se administreazã mai uşor. In cazul vaccinului polio, o singurã dozã administratã oral este suficientã pentru a crea o bunã stare de protecţie.

Dezavantajele vaccinurilor virale atenuate sunt legate de riscul ridicat al contaminãrii cu agenţi infecţioşi supraadãugaţi. De exemplu, loturile iniţiale de vaccin polio, au fost contaminate cu SV_4o, din celulele de rinichi de maimuţã, dar nu s-a constatat creşterea incidenţei tumorilor la copiii vaccinaţi. Vaccinul atenuat al virusului febrei galbene, multiplicat în fibroblastele de embrion de gãinã, a fost contaminat iniţial cu virusul leucozei aviare.

Unele virusuri atenuate (rujeolic, rubeolic, al febrei galbene) pãstreazã un nivel scãzut de virulenţã rezidualã, care determinã infecţii la copiii cu imunodeficienţe.

O problemã importantã, legatã de infecţiozitatea vaccinurilor atenuate, este aceea a restaurãrii unui grad variabil de virulenţã dupã vaccinare, care determinã infecţii cu manifestãri clinice la copiii imunodeficienţi. Procesul infecţios nu este consecinţa alterãrii genetice a virusului din vaccin. Din aceastã cauzã, vaccinul nu se administreazã gravidelor.

Vaccinurile atenuate ridicã problema instabilitãţii genetice. Virusul rujeolic atenuat este labil, în special la variaţiile termice şi de aceea necesitã un regim termic constant (+4^o), pe toatã durata depozitãrii.

Un alt dezavantaj constã în faptul cã virusul atenuat poate sã producã o infecţie persistentã. De asemenea, administrarea vaccinului atenuat poate sã interfere cu virusul de tip sãlbatic care infecteazã natural şi sã domine pânã la anulare eficienţa vaccinãrii. De exemplu, virusul polio atenuat, se administreazã pe cale oralã, dar poate sã interfere cu o largã varietate de enterovirusuri.

Vaccinurile inactivate conţin virioni care, dupã tratamentul cu agentul chimic inactivant nu pot sã iniţieze ciclul de multiplicare în substratul permisiv.

Preparatul viral brut se obţine prin cultivarea virusului într-un substrat permisiv: în oul embrionat de gãinã (virusul influenza), în culturi celulare de rinichi de maimuţã (virusul polio), sau în fibroblastele umane de embrion de gãinã (polio, rujeolic, rabic). Preparatul brut se inactiveazã cu formol, acetil-etilenimina sau cu beta-propiolactona.

Preparatele virale inactivate, utilizabile ca vaccin au avantajul riscului minim al infecţiei. Rareori, preparatele inactivate conţin virus infecţios rezidual, care a rezistat tratamentului de inactivare, sau care provine din contaminarea cu un alt virus.

Vaccinurile virale inactivate au câteva dezavantaje. Uneori, tratamentul cu un agent chimic anuleazã imunogenitatea unor proteine virale, astfel încât rãspunsul imun faţã de virusul inactivat nu este protector. De exemplu, inactivarea cu formol a virusului rujeolic anuleazã imunogenitatea proteinei de fuziune (F), iar vaccinul îşi pierde proprietatea protectoare.

Vaccinurile inactivate nu stimuleazã imunitatea mediatã celular (mediatã de limfocitele Tc), care au rol decisiv în eliminarea celulelor infectate cu virus şi în rezistenţa la infecţiile cu o gamã largã de virusuri.

Preţul de cost al vaccinurilor inactivate este mai mare.

Preparatele virale inactivate, folosite ca vaccinuri, se obţin din virusul rabic cultivat în CDU şi în embrionul de raţã, din virusul oreionului şi din virusul influenza, cultivate în embrionul de gãinã, din virusul polio, cultivat în celulele de rinichi de maimuţã. Toate sunt inactivate cu beta-propiolactonã sau cu formol.

Preparatul inactivat al virusului hepatitei B este o realizare recentã, dar este foarte costisitor pentru cã virusul nu se cultivã în sisteme celulare in vitro, iar tehnicile de purificare a virusului din serul pacienţilor infectaţi cronic sunt foarte laborioase.

Vaccinuri subunitare 

Iniţial, vaccinurile s-au obţinut din preparatele brute de virus, dupã multiplicarea lor într-un ţesut (in vivo) sau în culturi celulare. Pe mãsurã ce a fost posibilã obţinerea unor titruri înalte de virus, în scopul diminuãrii toxicitãţii vaccinului, s-a trecut la purificarea virusului şi a unor componente virale.

Vaccinurile subunitare conţin proteine virale în care se gãsesc localizate situsuri antigenice majore şi care se pot substitui  virionilor în practica vaccinãrii. De exemplu, pentru virusul influenza, vaccinul subunitar conţine antigenele de suprafaţã HA şi NA. Preparatul este mai puţin toxic decât virusul integral inactivat, dar este mai puţin eficient în stimularea rãspunsului imun.

Celulele mamaliene reprezintã un sistem optim pentru producerea proteinelor virale, utilizabile ca vaccinuri subunitare. Celulele în culturã se infecteazã cu virus şi din lizatele celulare se purificã antigene proteice. În lizate se gãseşte o cantitate mare de proteine virale în exces, neîncorporate în virioni.

Obţinerea vaccinurilor subunitare proteice, în culturile de celule animale ridicã probleme dificile de purificare a proteinelor virale, din amestecul cu proteinele celulare. Dacã se folosesc linii celulare continue, trebuie îndepãrtat ADN celular, potenţial oncogen.
 

Tehnici moderne de obţinere a vaccinurilor subunitare

Dezvoltarea biologiei moleculare şi cunoaşterea mecanismelor rãspunsului imun, a stimulat preocupãrile privind obţinerea unor vaccinuri noi. Utilizarea anticorpilor monoclonali a fãcut posibilã identificarea epitopior cu rol esenţial în stimularea rãspunsului imun, iar genele codificatoare ale antigenelor, au fost clonate prin tehnicile de inginerie genicã.

Genele codificatoare ale antigenelor protectoare, se pot izola dupã fragmentarea genomului sub acţiunea cataliticã a enzimelor de restricţie. Prin tehnologia ADN recombinant, genele se inserã în celula procariotã (E. coli,
B. subtilis), sau în celulele eucariote (levuri, celule mamaliene).

Fragmentarea genomului cu endonucleaze de restricţie este posibilã numai pentru dezoxiribovirusuri. Genomul ARN trebuie mai întâi transcris în ADNc şi ulterior poate fi utilizat în tehnicile de ADN recombinant. Genomul ARN de polaritate pozitivã este adecvat scopului clonãrii, dar nu a fost clonat ADNc al unei catene de ARN de polaritate negativã.

Celulele de mamifere reprezintã substratul optim pentru clonarea genelor şi pentru producerea proteinelor virale, deoarece plierea, transportul celular şi prelucrarea proteinelor sunt asemãnãtoare celor ce au loc în celula infectatã de virusul natural. Celulele produc cantitãţi mari de antigen viral, codificate de gena clonatã.

Tehnicile de clonare genicã se folosesc pentru sinteza proteinelor unor virusuri, care nu se multiplicã in vitro, în sistemele celulare uzuale. De exemplu, gena pentru sinteza antigenului HBs a fost inseratã într-o plasmidã şi clonatã de levuri. Proteina viralã este neglicozilatã, dar este imunogenã pentru om şi induce sinteza anticorpilor protectori faţã infecţia naturalã. S-au clonat genele codificatoare ale glicoproteinelor de HSV, VEB, HIV, VRS (virusul respirator sinciţial).

Pentru purificarea glicoproteinelor virale din celulele infectate în care a fost clonatã gena, s-a folosit tehnica cromatografiei de afinitate cu anticorpi monoclonali sau alte tehnici de separare (cromatografia cu lectine, tehnici de separare fizicã).

ADN viral este funcţional chiar în celula procariotã, dupã transferul prin intermediul unui vector (plasmidã sau fag). Astfel s-au sintetizat antigene de poliovirus, antigenul HBs, antigenul virusului hepatitei A, HA şi NA ale virusului gripal.

O variantã a tehnicilor de ADN recombinant este aceea de obţinere a vaccinurilor cu virusul vaccinal hibrid. Genomul poxvirusurilor codificã circa 200 de proteine. Unele  sunt esenţiale pentru multiplicarea viralã, dar un interes deosebit prezintã genele neesenţiale pentru ciclul de multiplicare. Ele reprezintã circa 30% din genom şi sunt grupate la extremitãţile genomului ADN dublu catenar linear. In plus, genomul este împachetat lax în virion. Aceste particularitãţi au permis obţinerea, prin tehnicile de inginerie genicã, a poxvirusurilor recombinate, infecţioase, capabile sã exprime genele strãine inserate în genomul lor.

ADN viral este inserat în genomul virusului vaccinal prin recombinare la situsuri omologe. Virusul vccinal hibrid se multiplicã în celulele permisive şi genele inserate în genomul sãu codificã antigenul HBs, antigenul rabic, antigenul HSV etc.

Vaccinurile virale hibride sunt stabile şi stimuleazã ambele compartimente ale rãspunsului imun.

O altã cale de producere a vaccinurilor virale atenuate, genetic stabile, implicã obţinerea mutantelor de deleţie. Acestea au o capacitate diminuatã de multiplicare, ceea ce echivaleazã cu atenuarea. Mutantele prin deleţie trebuie sã-şi pãstreze infecţiozitatea şi imunogenitatea şi sã fie stabile genetic.

Antigene peptidice sintetice. Producerea şi utilizarea antigenelor sintetice s-au impus dupã demonstrarea bazelor moleculare ale imunogenitãţii şi dupã studiile privind proprietãţile imunogene ale  antigenelor artificiale. Pe de altã parte, s-a demonstrat ca macromoleculele proteice sau glicoproteice din structura virusurilor şi a microorganismelor infecţioase, au un numãr mare de determinanţi antigenici, dar numai un numãr limitat dintre aceştia au  semnificaţie imunogenã şi un numãr foarte mic sunt inductori ai rãspunsului imun protector.

Sinteza artificialã a peptidelor a devenit posibilã dupã introducerea metodelor de secvenţiere a ADN. Cunoaşterea secvenţei bazelor a permis dirijarea secvenţei de aminoacizi a proteinelor cu activitate biologicã.

Vaccinurile sintetice conţin secvenţe polipeptidice sintetizate pe cale chimicã. Ele includ determinanţi antigenici esenţiali pentru inducerea unui rãspuns imun protector faţã de agenţii patogeni corespunzãtori.

Condiţia esenţialã pentru obţinerea vaccinurilor sintetice este cunoaşterea structurii chimice a determinanţilor antigenici nativi ai virusului (sau ai microorganismelor patogene) şi identificarea regiunilor imuno-dominante ale moleculei.

Tehnicile de cristalografie cu raze X, cromatografia în faza lichidã, au permis identificarea situsurilor antigenice majore ale unor virusuri foarte importante pentru clinicã. De exemplu, s-a determinat structura tridimensionalã a hemaglutininei virusului gripal şi s-au identificat regiunile calde ale moleculei, care, cu mare probabilitate, corespund determinanţilor antigenici. S-a stabilit secvenţa aminoacizilor, care a fost reprodusã în proteinele sintetizate artificial.

Marea majoritate a peptidelor sintetice sunt secvenţe scurte, lineare de aminoacizi, care reproduc un fragment din structura primarã a moleculei proteice. Dezavantajul major este cã secvenţele sintetice nu reproduc configuraţia spaţialã a determinanţilor antigenici naturali, în special a celor discontinui. Aceştia sunt alcãtuiţi din resturi de aminoacizi neadiacenţi în structura primarã a moleculei, dar pot fi juxtapuşi în structura tridimensionalã a proteinei pliate. Astfel se explicã slaba imunogenitate a peptidelor sintetice. Ameliorarea calitãţilor de imunogenitate ale peptidelor sintetice, utilizabile ca vaccinuri, depinde de gradul de asemãnare a conformaţiei lor, cu determinantul antigenic nativ.

Dimensiunile mici ale peptidelor sintetice impun cuplarea lor cu o moleculã purtãtor, pentru creşterea gradului de imunogenitate. S-a folosit hemocianina de Megathura (KHL), cuplatã prin intermediul glutaraldehidei sau a unei grupãri tiol a unui rest de cisteinã, adãugat la o extremitate a secvenţei sintetice.

S-au sintetizat peptide care reproduc secvenţe de aminoacizi ale unor polipeptide ale virusului hepatitei B, cu diferite eficienţe imunoprotectoare, precum şi peptide care reproduc unele secvenţe ale hemaglutininei virusului gripal.

Polipeptidele sintetice utilizate ca vaccinuri, au avantajul cã nu conţin alte componente care ar putea produce efecte secundare şi stimuleazã rãspunsul imun strict specific faţã de epitopii antigenici  critici ai agentului infecţios. Sunt stabile indefinit şi se produc la un preţ de cost scãzut. Au însã dezavantajul major de a nu stimula rãspunsul imun mediat celular.

Vaccinurile care conţin virioni inactivaţi şi anatoxinele se administreazã, în general, pe cale parenteralã (subcutan, intradermic, intramuscular), în mod obişnuit în trei injecţii separate la intervale de 5, 7 şi respectiv 21 de zile.

Vaccinurile bacteriene vii şi cele virale atenuate se administreazã într-o singurã dozã, în general, pe cale parenteralã. Vaccinul BCG, ca şi vaccinul polio infecţios atenuat, la nou nãscuţi se administreazã pe cale oralã.

Imunitatea consecutivã vaccinãrii se instaleazã relativ lent, la circa 15-20 de zile de la ultima injecţie şi are o duratã variabilã de la  un vaccin la altul (în general, între 1 şi 7 ani), scãzând treptat pânã la dispariţia completã. Vaccinarea primarã, ca şi infecţia, conferã organismului o stare specialã de reactivitate imunitarã - memoria imunitarã - graţie cãreia, orice contact ulterior cu agentul patogen respectiv, realizat pe cale naturalã(infecţie şi boalã) sau pe cale artificialã(prin vaccinare) declanşeazã o “redeşteptare” rapidã a imunitãţii, care se manifestã cu o intensitate mai mare decât aceea a rãspunsului imun postvaccinal. Cea de a II-a administrare a vaccinului declanşeazã o reacţie anamnesticã (de memorie), cu o creştere bruscã şi masivã a titrului anticorpilor.

Deşi în general este solidã, imunitatea postvaccinalã este relativã, în sensul cã unele persoane vaccinate pot totuşi sã facã boala într-o formã mai uşoarã, mai ales consecutiv unei infecţii masive cu un agent patogen deosebit de virulent.

Datoritã faptului cã se instaleazã lent, imunizarea prin vaccinare se foloseşte în scop profilactic pentru a evita riscul infecţiei cu un agent patogen.

Imunitatea dobânditã artificial pasiv
 

Serurile imune sau terapeutice sunt produse biologice obţinute din serul sanguin al unui animal imunizat prin vaccinare sau din serul unui convalescent imunizat prin infecţie naturalã sau prin vaccinare. Serul imun conţine anticorpi specifici, capabili sã neutralizeze acţiunea antigenului corespunzãtor. Primele încercãri de folosire a serurilor în terapeuticã dateazã din 1888, când Richet şi Hericourt au demonstrat cã inocularea organismelor animale cu agenţi patogeni, determinã apariţia în ser a anticorpilor, cu efect protector nu numai pentru organismul care i-a sintetizat, dar şi pentru organismele cãrora li se injecteazã serul imun.

În general, serurile imune se preparã pe animale mari (cal), care sunt hiperimunizate, dupã principiile imunizãrii active, cu doze repetate crescânde de celule, virioni, anatoxine sau toxine. Serul sanguin obţinut prin sângerarea animalelor imunizate este inactivat şi tratat cu fenol (ca prezervant), controlat pentru sterilitate, inocuitate (lipsa de nocivitate) şi pentru eficacitate (titrul de anticorpi). Serul imun se administreazã sub formã de injecţii intravenoase, intramusculare sau subcutane, în special în scop terapeutic.

Dupã cum specia organismului donor este sau nu aceiaşi cu a organismului receptor, serurile imune pot fi omologe (serurile recoltate de la convalescenţi sau de la voluntarii imunizaţi prin vaccinare) sau heterologe (serurile obţinute prin imunizarea animalelor).

Dupã natura antigenelor folosite, se disting trei categorii de seruri imune: a) seruri imune antimicrobiene, obţinute prin administrarea antigenelor celulare (de exemplu, serurile antistreptococice şi antimeningococice); b) seruri antitoxice, obţinute prin imunizarea organismelor cu toxine şi anatoxine (de exemplu, serurile antidifteric şi antitetanic); c) seruri imune mixte (antimicrobiene şi antitoxice), obţinute prin imunizarea cu antigene celulare şi cu toxine (de exemplu, serul antigangrenos).

Imunitatea pasivã, consecutivã administrãrii serurilor imune se instaleazã imediat dupã injectarea intravenoasã sau dupã câteva ore, pe mãsura resorbţiei anticorpilor, în cazul administrãrii pe alte cãi. Imunitatea pasivã asigurã o protecţie de scurtã duratã (circa 30 de zile), datoritã faptului cã anticorpii primiţi în mod pasiv au un “timp de înjumãtãţire” de 14 zile. Persistenţa lor este mai îndelungatã dacã serul este homolog. Dupã catabolizarea anticorpilor exogeni, organismul redevine receptiv la infecţie. Datoritã acestei particularitãţi, serurile imune sunt folosite în special pentru tratamentul unei maladii infecţioase în evoluţie (seroterapie).

Serurile imune (antitoxice, antivirale, antibacteriene) acţioneazã prin opsonizarea moleculelor de toxinã, a virionilor şi a celulelor bacteriene. Efectul este de neutralizare a toxinei şi a infecţiozitãţii virale, iar celulele bacteriene tapetate cu anticorpi devin sensibile la acţiunea fagocitelor şi a complementului.

Serurile imune pot fi folosite şi în scop profilactic (seroprofilaxie), la persoane care au fost sigur în pericol de a se infecta şi la care se urmãreşte prevenirea declanşãrii maladiei în forma clinicã. Pentru a evita riscurile de infecţie, care pot surveni dupã epuizarea imunitãţii pasive, se recomandã ca seroterapiei şi seroprofilaxiei sã li se asocieze vaccinarea, pentru pãstrarea stãrii de imunitate dupã catabolizarea anticorpilor exogeni.

Datoritã riscului crescut al producerii reacţiilor imune secundare (alergie, şoc anafilactic), OMS recomandã înlocuirea serurilor hiperimune obţinute pe animale (heterologe), cu cele umane obţinute de la donori hiperimunizaţi voluntar sau de la convalescenţi (homologe).

În prezent se folosesc seruri imune concentrate şi purificate, din care s-au eliminat circa 3/4 din proteinele serului sanguin, pãstrându-se numai fracţia globulinicã specificã. Prin acest procedeu s-a redus foarte mult volumul serului injectat şi se evitã accidentele care ar putea rezulta din sensibilizarea organismului uman faţã de proteinele nespecifice din serul heterolog.

REZISTENŢA ANTIINFECŢIOASÃ
ÎNNÃNASCUTÃ NESPECIFICÃ

Prin imunitate sau rezistenţã naturalã, înãscutã sau congenitalã se înţelege capacitatea unui organism de a fi rezistent faţã de un agent infecţios, în absenţa unui rãspuns imun detectabil. Aceastã proprietate este înãscutã pentru organismele unei specii şi în mod obişnuit este absolutã, adicã toţi indivizii speciei respective sunt rezistenţi faţã de un anumit patogen, chiar în cazul inoculãrii cu doze mari ale agentului infecţios. De exemplu, omul este rezistent la agenţii patogeni care produc zoonoze (agentul pestei bovine, al pestei porcine, al holerei gãinilor etc.), iar animalele sunt rezistente la gonoree, rujeolã, oreion, dizenterie, gripã etc.

Starea de rezistenţã naturalã nu este condiţionatã de contactul anterior cu agentul patogen respectiv, ci este consecinţa unei modalitãţi prompte de reacţie a organismului. Starea diametral opusã este aceea de receptivitate sau de sensibilitate (susceptibilitate), caracteristicã organismelor care, ca rezultat al agresiunii unui agent patogen, reacţioneazã prin apariţia unui proces infecţios. Starea de nereceptivitate este, uneori, relativã, în sensul cã existã deosebiri individuale de reactivitate în cadrul speciei, unii indivizi fiind total rezistenţi, iar alţii prezintã diferite grade de receptivitate. Rãspunsul diferit al organismelor unei specii, la contactul cu un agent patogen, este rezultatul eficienţei variabile a forţelor de apãrare a organismului, care, izolate sau în asociaţie, opun agentului patogen o barierã de nepãtruns, determinã inhibarea multiplicãrii sau distrugerea lui în ţesuturi sau umori, precum şi neutralizarea şi eliminarea substanţelor toxice eliberate. Diferenţele sunt, probabil, rezultatul acţiunii unor factori genetici. De exemplu, oile din Alger sunt mult mai rezistente la infecţia cãrbunoasã (produsã de B. anthracis), decât cele din Europa. La primele, macrofagele conţin un numãr mai mare de lizosomi şi enzimele componente au activitate hidroliticã mult mai intensã. S-au evidenţiat diferenţe de sensibilitate a raselor umane la tuberculozã: populaţiile africane sunt mai sensibile. Influenţele de ordin genetic asupra rezistenţei naturale au condus la concluzii de ordin practic. Pe acest criteriu se face selecţia populaţiilor (liniilor) genetic pure ale animalelor de laborator, care au o rezistenţã foarte mare faţã de un agent patogen sau o sensibilitate deosebitã.

Ori de câte ori un agent patogen vine în contact cu un organism neimunizat, iniţierea procesului infecţios este stopatã, în primul rând prin intrarea în acţiune a mecanismelor rezistenţei constitutive, nespecifice, reprezentate de barierele mecanice (tegumentul şi mucoasele), de componentele moleculare antiinfecţioase a cãror sintezã este amplificatã în reacţia inflamatorie, de componentele celulare care au capacitatea de fagocitozã. Ulterior, dacã barierele rezistenţei nespecifice au fost depãşite, intrã în acţiune sistemul imunitar. Mecanismele de apãrare antiinfecţioasã, specifice şi nespecifice, sunt strâns integrate funcţional, astfel încât, acţiunea lor este totdeauna combinatã. De exemplu, epiteliul tubului digestiv secretã lizozim, ca factor al rezistenţei înãscute, iar în stratul de mucus care îl tapeteazã se gãseşte IgA, ca factor al imunitãţii dobândite.

Barierele mecanice de apãrare a organismului sunt reprezentate de tegument şi de mucoase. Epiteliul tegumentar şi mucoasele sunt structurile care limiteazã accesul agenţilor infecţioşi, constituind în primul rând bariere fizice, dar la acest nivel funcţioneazã mecanisme moleculare şi celulare cu rol neutralizant sau litic faţã de microorganisme şi virusuri. Deşi contactul lor cu microbiota normalã sau potenţial patogenã este permanent, aceste structuri sunt deosebit de eficiente ca bariere mecanice protectoare faţã de infecţii. Particularitãţile lor funcţionale sunt conferite de integritatea anatomicã, de secreţiile proprii, de reînoirea prin descuamare, de impermeabilitatea sau de permeabilitatea lor selectivã. Astfel, tegumentul intact este impermeabil pentru virusuri şi microorganisme, dar alterarea structurii sale, în special dupã arsuri, este urmatã de infecţii.

Suprafaţa tegumentului este acoperitã cu o peliculã finã, formatã din produsele de secreţie ale glandelor sudoripare şi sebacee, cu pH acid (pH = 3,0-5,0), care au efect bacteriostatic. Dupã îndepãrtarea (prin spãlare) peliculei de secreţie, funcţia protectoare antiinfecţioasã a tegumentului diminuã.

Conjunctiva este protejatã prin acţiunea mecanicã şi chimicã a secreţiei lacrimale, în care se gãseşte lizozim. Lizozimul este o proteinã cationicã micã, prezentã în toate fluidele organismului, cu efect enzimatic, hidrolizând legãturile glicozidice ale peptidoglicanului parietal bacterian.

Mucoasele sunt acoperite de secreţii. Lactoferina este o glicoproteinã care leagã Fe²⁺. La nivelul tractului respirator, rolul protector faţã de agenţii infecţioşi este îndeplinit de mucinele cu efect neutralizant, iar expulzarea lor este asiguratã prin mişcarea cililor celulelor epiteliale şi prin reflexele de strãnut şi de tuse. Mucinele formeazã un strat mucos vâscos, ce tapeteazã mucoasele digestive şi respirator. Ele capteazã microorganismele şi antigenele, limitând penetrarea lor în ţesuturi.

Histatinele(peptide bogate în histidinã) formeazã o familie micã de peptide bazice de 3-5 kD, produse de celulele acinare salivare şi pancreatice. Ele inhibã dezvoltarea celulelor de C. albicans, în forma infecţioasã sau neinfecţioasã.

Cistatinele sunt fosfoproteine ce conţin cisteinã, secretate de celulele acinare. Au efect inhibitor asupra creşterii microorganismelor.

Mucoasa gastricã este protejatã de gelul mucos care o tapeteazã, ce formeazã un adevãrat glicocalix şi de aciditatea conferitã de HCl, component al sucului gastric. Bacteriile Gram negative sunt foarte sensibile la acţiunea mediului acid gastric. Dupã neutralizarea aciditãţii gastrice cu substanţe alcaline, capacitatea sa protectoare diminuã pânã la dispariţie şi infecţiile se instaleazã rapid. Totuşi, pe cale digestivã pãtrund agenţii patogeni a numeroase maladii infecţioase, evitând bariera aciditãţii gastrice. Bolul alimentar este protector faţã de aciditate şi în interiorul sãu existã condiţii favorabile supravieţuirii agenţilor patogeni ingeraţi odatã cu alimentele.

Secreţiile mucoase, în compoziţia cãrora intrã mucinele (glicoproteine), au rol important în apãrarea antiinfecţioasã. Mucinele aderã la suprafaţa agenţilor patogeni şi a paraziţilor, formând un strat molecular care împiedicã interacţiunea lor cu celulele epiteliale. Lor li se atribuie de asemenea, un rol neutralizant asupra toxinelor. În acelaşi timp, secreţiile formeazã o peliculã (film) protectoare, continuã pe suprafaţa mucoasei, constituind o barierã greu de trecut pentru microorganisme în calea lor spre situsurile epiteliale de aderenţã. Pelicula eliminã bacteriile care nu se pot adapta condiţiilor de sub peliculã, la graniţa mucus-epiteliu.

Un alt mecanism nespecific care controleazã creşterea microorganismelor la zona de contact cu mucoasa digestivã, este peristaltismul intestinal. Microorganismele aderã la mucoasa epitelialã, prin intermediul unor molecule din categoria lectinelor, care realizeazã adevãrate punţi de legãturã între suprafaţa bacteriei şi a celulei epiteliale. Peristaltismul intestinal împiedicã realizarea acestor interacţiuni stabile, creind un flux care deplaseazã microorganismele patogene, înainte ca ele sã colonizeze suprafaţa epiteliului. Numeroase infecţii intestinale accelereazã peristaltismul. Anomaliile mişcãrilor peristaltice sunt factori favorizanţi ai creşterii excesive a populaţiilor bacteriene ale microbiotei normale a tractului intestinal. In absenţa unui clearance mecanic normal al tractului digestiv, microbiota normalã poate dobândi un rol patologic.

Rolul factorilor humorali în apãrarea antiinfecţioasã nespecificã. Hormonii au un rol esenţial în reglarea unor mecanisme homeostatice. Ei nu modificã specificitatea de reacţie a celulelor limfoide. Concentraţiiile optime de hormoni determinã o funcţionalitate optimã a sistemului imunitar, iar modificãrile lor cantitative induc perturbãri ale metabolismului limfocitelor. Pubertatea şi sarcina se caracterizeazã prin creşterea steroizilor plasmatici. Cunoaşterea multiplelor interacţiuni dintre funcţia imunitarã şi sistemul endocrin, precum şi perfecţionarea tehnicii de radioimunodozare (RIA) a hormonilor, au condus la delimitarea unei noi discipline intermediare – imunoendocrinologia.

Afecţiunile de naturã endocrinã au un rãsunet major în raport cu rezistenţa nespecificã faţã de agenţii patogeni. Un exemplu în acest sens este patologia infecţioasã asociatã cu diabetul. Bolnavii de diabet fac în mod frecvent infecţii de tip tuberculos, infecţii urinare şi tegumentare de tipul furunculozelor. Ele se datoreazã fie unor dezechilibre locale provocate de lipsa insulinei, fie glicemiei crescute.

Hormonii tiroidieni influenţeazã rezistenţa faţã de infecţii. Hipotiroidismul mãreşte incidenţa infecţiilor.

Cortizolul are influenţã directã asupra limfocitelor. Hipofuncţia cortexului  glandelor suprarenale mãreşte rezistenţa faţã de agenţii infecţioşi.

Capacitatea autosterilizantã a umorilor este un factor decisiv al rezistenţei nespecifice. In ţesuturi şi în umori se gãsesc substanţe cu rol antibacterian: lizozimul, lactoferina etc. Astfel se explicã rezistenţa organismului faţã de numeroasele agresiuni ale microorganismelor, care pãtrund permanent în ţesuturi, pe diferite cãi. Microorganismele (în special bacterii) trec din lumenul intestinal în sânge, la toate animalele, inclusiv la om, datoritã condiţiilor speciale de permeabilitate a epiteliului, create în timpul absorbţiei intestinale. Permeabilitatea mucoasei este mai accentuatã la rumegãtoare. La om s-a evidenţiat cã, postprandial, se produce o bacteriemie temporarã, originarã în cavitatea bucalã, ca rezultat al masticaţiei sau al periajului dentar. Dupã extracţia dentarã, existã chiar o perioadã septicemicã (cu multiplicare bacterianã). Datoritã stãrii de bacteriemie temporarã, animalele nu trebuie hrãnite o perioadã de 10-20 de ore înainte de sacrificare.

În mod obişnuit, stãrile de bacteriemie fiziologicã nu sunt urmate de infecţii clinice, datoritã capacitãţii autosterilizante (clearance) a ţesuturilor şi umorilor, care se manifestã prin mecanisme variate:

- condiţiile tisulare improprii multiplicãrii microorganismelor şi în primul rând concentraţia O₂: microorganismele strict anaerobe nu se multiplicã în ţesuturile bine oxigenate, ci numai în cele traumatizate sau devitalizate. De exemplu, C. perfringens, agentul gangrenei gazoase creşte în plãgile musculare provocate de explozii, iar M. tuberculosis (strict aerob) se localizeazã preferenţial la nivelul ţesutului pulmonar. Dupã distrugerea liticã a granulomului, se formeazã un ţesut cazeos în care O₂ nu difuzeazã. Se creeazã condiţii de anaerobie, improprii multiplicãrii celulelor de M. tuberculosis şi astfel evoluţia infecţiei este limtatã;

- substanţe din categoria lizinelor

- properdina

- sistemul complement

- interferonii

- proteina C reactivã

Rolul acestor componente humorale în apãrarea antiinfecţioasã şi mecanismele acţiunii lor vor fi prezentate în acest capitol.